桑黃抗氧化活性成分的篩選及基分離純化.pdf

1、桑黃(Phellinus sp.),俗稱桑黃菇、桑臣、桑耳等,是擔子菌亞門層菌綱多孔菌目多孔菌科針層菌屬的一種珍貴的藥用真菌。子實體入藥最佳,味微苦,能利五臟、排毒、活血等。文獻報道,桑黃子實體具有抗腫瘤、增強免疫力、抗誘變功能、降血糖等活性。特別是桑黃的抗氧化活性引起人們的關注,本論文對不同品種、不同培養(yǎng)方式得到的桑黃原料中的抗氧化活性成分進行了篩選、分離、純化及體外抗腫瘤和修復神經細胞的生物活性研究。本論文的研究結果對了解桑黃抗氧化

2、的活性成分及開發(fā)相關產品有一定的理論參考價值。本論文分四個部分,主要研究結果如下:
　　 1、比較不同品種桑黃子實體化學成分和生物活性的差異,篩選出抗氧化活性較高的品種
　　 以具有抗氧化活性的多糖和黃酮為主要指標,通過比較八種桑黃子實體多糖和黃酮含量差異及生物活性的高低,選取優(yōu)良品種進行活性物質的分離純化研究。采用水提醇沉法提取了八種不同桑黃子實體的粗多糖,測定了八種桑黃粗多糖中多糖和蛋白質含量,分析了其單糖組成和氨基

3、酸成分,同時對八種桑黃粗多糖清除活性氧自由基和刺激淋巴細胞增殖的活性進行來的檢測。結果表明,八種桑黃水提醇沉物中多糖和蛋白質的含量有較大差異,單糖組成、氨基酸種類和含量也存在有一定的差異,其中PB-10的多糖得率(2.9％)和多糖含量(48.3％)較其他七種桑黃高,且PB-10粗多糖清除活性氧自由基能力也最高,其清除超氧陰離子、羥基、H2O2自由基的IC50值分別為0.45±0.13mg／mL,20.52±4.76μg／mL,16.47

4、±1.53μg／mL。體外刺激小鼠脾淋巴細胞增殖的實驗結果顯示,PB-10和JSH粗多糖在50μg／ml濃度時淋巴細胞的增殖率為286.84％。
　　 PB-10子實體70％乙醇提取物的體外抗氧化活性(超氧陰離子、羥基、H2O2自由基的清除)實驗表明,其清除超氧陰離子、羥基自由基以及H2O2的IC50值分別為11.13±2.32μg／mL,、0.53±0.13μg／mL和1.38±0.97μg／mL,較桑黃粗多糖有更好的抗氧化活

5、性。
　　 2、比較了培養(yǎng)方式對桑黃化學成分及抗氧化活性的影響
　　 通過比較同一桑黃菌株的發(fā)酵培養(yǎng)菌絲體和人工栽培子實體中的黃酮類物質含量及其抗氧化活性發(fā)現(xiàn)人工栽培桑黃子實體醇提物中黃酮的含量(52.42％)高于發(fā)酵菌絲體醇提物黃酮含量(16.74％)；其抗氧化活性(清除超氧陰離子、H2O2、DPPH的IC50值分別為34.65±8.91μg／ml、4.71±0.91ng／ml、8.18±1.14g／ml)能力均明顯高

6、于發(fā)酵菌絲體(清除超氧陰離子、H2O2、DPPH的IC50值分別為56.67±11.41μg／ml、7.65±0.49ng／ml、15.90±3.32g／ml)。對椴木栽培一年生、兩年生桑黃子實體醇提物、水提物中黃酮、三萜、多糖含量及其抗氧化(還原力測定、H2O2和DPPH的清除)、體外細胞免疫活性進行了分析比較,結果表明,一年生桑黃子實體的黃酮、三萜和多糖的含量略高于兩年生桑黃；抗氧化活性優(yōu)于兩年生桑黃。
　　 3、桑黃子實體

7、抗氧化活性成分的分離純化及結構分析
　　 采用四種不同極性的有機溶劑對桑黃乙醇提取液依次萃取得到石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相和醇水相。對五種萃取相分別進行了清除NO自由基、超氧陰離子、羥基自由基、H2O2自由基、DPPH自由基,還原力測定以及抗脂質過氧化實驗。實驗結果表明,乙酸乙酯相在清除超氧陰離子、羥基、H2O2及DPPH自由基實驗中的IC50值分別為2.98±0.01μg／ml、0.041±0.001μg／ml、0

8、.24±0.07μg／ml、3.89±0.02μg／ml,高于其它萃取相；并且乙酸乙酯相還具有較強的還原力和抗脂質過氧化能力。研究發(fā)現(xiàn)五種萃取相的抗氧化活性與其黃酮含量有一定的相關性。
　　 用硅膠、Sephadex LH-20和聚酰胺等對抗氧化活性較高的乙酸乙酯相繼續(xù)進行分離純化,經過柱層析和重結晶反復純化,得到4個單一化合物:PB-EA-1、PB-EA-2、PB-EA-3、PB-EA-4。對純化后的樣品進行1HNMR,13C

9、NMR,DEPT,1H-1HCOSY,HMQC等波譜分析并結合相關文獻報道數(shù)據,鑒定出化合物PB-EA-3化學式為C25H18O9,其被命名為Inoscavin A
　　 4、分離純化組分的抗氧化、抑制腫瘤細胞生長和保護神經細胞的活性
　　 對PB-EA-2、PB-EA-3、PB-nB三種樣品進行抗氧化實驗,并通過抑制腫瘤細胞生長和修復損傷神經細胞實驗來觀察有抗氧化活性組分的其他藥理活性。研究表明,PB-EA-3較乙酸乙