棉花促絲裂原活化蛋白激酶（GhMAPK）基因的分離與功能分析.pdf

1、促絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-actweed protein kinase，MAPK)是普遍存在于真核生物中的一類保守的絲氨酸/蘇氨酸類蛋白激酶。MAPK．級聯(lián)途徑(MAPKKK-MAPKK-MAPK)通過依次磷酸化傳遞環(huán)境信號，參與植物生長發(fā)育和多種生物、非生物脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。 近年來許多研究發(fā)現(xiàn)MAPK與植物病原信號傳遞關(guān)系相當(dāng)密切，并鑒定多種受病原侵染誘導(dǎo)的MAPK。棉花是一種重要的經(jīng)濟作物，利用基因工程方法培育棉花

2、抗病新品種已經(jīng)成為棉花育種的研究熱點。本文以魯棉22為材料，首次從棉花中克隆了MAPK基因(GhMAPK)，并對其進行了序列比對，表達特性分析及功能鑒定。具體結(jié)果如下： 1．根據(jù)同源序列設(shè)計簡并引物，通過RT-PCR和RACE-PCR的方法從棉花(Gossypium hirsutum)中克隆到一個MAPK：基因，命名為GhMAPK。GenB~k注冊號為DQl32852。其cDNA全長為1832bp，編碼一個372氨基酸蛋白質(zhì)。序

3、列分析發(fā)現(xiàn)GhMAPK具有蛋白激酶所保守的11個亞區(qū)和TEY特征磷酸化位點。與C組MAPK同源性最高，同來自于擬南芥、杏、矮牽牛、豌豆、煙草中的幾種MAPK同源性高達83-89％。cDNA序列與基因組序列比較后發(fā)現(xiàn)GhMAPK因組序列內(nèi)存在兩個內(nèi)含子。 2．Southem雜交說明在棉花基因組中可能存在多個與GhMAPK具有一定同源性的其他MAPK基因，或者可以說存在一個小的MAPK基因家族。Northem雜交發(fā)現(xiàn)GhMAPK轉(zhuǎn)錄

4、水平受機械損傷，高鹽，冷害等非生物脅迫誘導(dǎo)而提高；植物抗病反應(yīng)相關(guān)信號分子SA和H<,2>O<,2>也能誘導(dǎo)GhMAPK表達；棉花幼苗接種棉花枯萎病菌后，GhMAPK表達量也有明顯提高，進一步證明了GhMAPK參與了病原侵染反應(yīng)過程。 3．將GhMAPK：構(gòu)建了正義植物表達載體pBI121-GhMAPK，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，轉(zhuǎn)化煙草(NC89)，同時轉(zhuǎn)空載體為對照。經(jīng)卡那霉素篩選獲得若干再生植株。經(jīng)過PCR鑒定，并選取部分轉(zhuǎn)基

5、因植株進行了Northem和Western雜交分析，結(jié)果證明GhMAPK在轉(zhuǎn)基因煙草中已成功得到表達。 4．選取兩個T<,0>代轉(zhuǎn)基因株系的自交種子擴繁，得到T<,1>代轉(zhuǎn)基因植株。在分子鑒定基礎(chǔ)上，對T<,1>代轉(zhuǎn)基因植株進行了生物學(xué)功能分析?？拐婢鷃實驗中，接種了黑脛病原菌(Phtophtora parasitica vat．nicotianae Tucker)的轉(zhuǎn)基因植株的抗病能力明顯高于對照植株。煙草花葉病毒(tobac