外周絲裂原活化蛋白激酶在蜜蜂毒肽誘致病理性痛中的作用.pdf

1、在過去的10年中，本研究組在LariviereandMelzack提出蜜蜂毒（Beevenom，BV）模型的基礎上進行了更進一步的研究。該模型的特點是可以模擬臨床病理性痛的三大表現(xiàn)，包括：1）持續(xù)性自發(fā)痛，2）原發(fā)性熱痛敏和機械痛敏，3）繼發(fā)性痛敏和“鏡像痛敏”。同時本研究組還應用在體電生理單細胞胞外記錄技術，在蜜蜂毒足底注射側(cè)脊髓背角相應節(jié)段誘導出脊髓背角廣動力域（wide-dynamic-range，WDR）神經(jīng)元自發(fā)放電反應增強及

2、對注射部位熱和機械刺激反應增強現(xiàn)象，其持續(xù)時程和反應形式與行為學的結(jié)果一致。隨后本研究組還對蜜蜂毒成分進行了深入研究，蜜蜂毒是含有二十余種成分的復合物，其主要成分包括：（1）蜜蜂毒肽（Melittin），是蜜蜂粗毒中最主要（在凍干的粗毒中占50％左右）的物質(zhì)成分；（2）蜂毒明肽（Apamin），在凍干的粗毒中僅占2％；（3）其他主要致傷害成分，如磷脂酶A2（12％）、透明脂酸酶（小于3％）、肥大細胞脫顆粒肽（2％）、組胺（1.5％）、M

3、elittinF等。因為已有報道稱皮下分別注射磷脂酶A2、透明脂酸酶、肥大細胞脫顆粒肽、組胺和5-HT等化學物質(zhì)不能引起像蜜蜂毒和福爾馬林那樣的長時程持續(xù)自發(fā)縮足反射行為，而且也不能長時程激活外周初級傳入C纖維和脊髓背角傷害性神經(jīng)元持續(xù)放電增強，所以推測這些物質(zhì)不是蜜蜂毒中主要致炎致痛成分。我們還應用行為藥理學、在體單細胞胞外記錄、離體單細胞全細胞膜片鉗記錄以及鈣成像等技術對蜜蜂毒肽的生物學作用及機制進行深入研究，發(fā)現(xiàn)蜜蜂毒肽（Meli

4、ttin）是蜜蜂毒中主要的致炎致痛化學成分，是蜜蜂毒誘發(fā)持續(xù)性自發(fā)痛、熱和機械痛敏以及炎癥反應的主要因素。它可以直接敏化外周初級感覺神經(jīng)元，開放細胞上辣椒素受體的非選擇性陽離子通道（transientreceptorpotentialvanilloid1，TRPV1），從而介導蜜蜂毒肽誘致的持續(xù)性自發(fā)痛和熱痛敏以及脊髓背角傷害性神經(jīng)元的功能改變，還可以通過激活磷脂酶A2－脂氧合酶代謝途徑并在胞內(nèi)蛋白激酶A、C的協(xié)助下調(diào)節(jié)TRPV1的開放

5、從而引起皮下注射蜜蜂毒肽后行為學上表現(xiàn)的持續(xù)性自發(fā)痛和熱痛敏等，并且已有人體實驗證明蜜蜂毒肽可以引起自發(fā)痛和原發(fā)性機械痛敏。
　　然而蜜蜂毒肽引起的多種痛相關行為的外周傳入機制還未完全清楚地描述。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activedproteinkinases,MAPKs）作為一類在進化中高度保守的蛋白激酶，參與了細胞內(nèi)部許多方面的調(diào)節(jié)，它通過將胞外刺激轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯后反應，從而將細胞表面的受體同胞內(nèi)關鍵的調(diào)

6、節(jié)目標聯(lián)系起來，在細胞信號傳導通路中發(fā)揮關鍵的作用。
　　在哺乳動物細胞中，有三個MAPK家族成員已經(jīng)得到比較清楚的描述，即ERK1/2（extracellularsignal-regulatedkinase1and2），c-JunN末端激酶/應激激活的蛋白激酶（JNK/SAPK，c-JunN-terminalkinase/stress-activedproteinkinase）和p38激酶。其中ERK、JNK以及P38絲裂原活化

7、蛋白激酶在蜂毒肽引起的傷害性刺激反應以及痛敏中是否發(fā)揮了作用？其ERK、JNK、P38的作用是否一致？當前的研究能否幫我們進一步闡述蜂毒肽引起的多種痛相關行為的外周傳入機制？于是我們展開了外周絲裂原活化蛋白激酶在蜜蜂毒肽誘致的病理性痛中作用的相關研究。實驗方法主要是在大鼠后足底皮下局部注射蜜蜂毒肽引起的炎癥反應部位先后分別注射細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（Extracellularsignal-regulatedkinase，ERK）抑制劑U01

8、26、c-Jun氨基末端激酶（C-JunN-terminalkinase，JNK）抑制劑SP600125以及P38絲裂原活化蛋白激酶抑制劑SB239063，通過行為藥理學的方法觀察它們在蜜蜂毒肽誘致的病理性痛中的作用。
　　結(jié)果：（1）在未進行任何處理的大鼠后足皮下注射ERK、JNK、P38抑制劑不能改變大鼠對熱反應的潛伏期和對機械刺激的反應閾值，這提示在正常生理狀態(tài)下，這三個主要外周絲裂原活化蛋白激酶亞家族成員在正常痛感覺傳遞過

9、程中作用較小。（2）通過前給藥方式ERK、JNK及P38抑制劑能明顯的抑制蜂毒肽誘發(fā)的持續(xù)性自發(fā)痛的產(chǎn)生，并呈劑量依賴性；通過后給藥的方式也能明顯的抑制蜂毒肽誘發(fā)的持續(xù)性自發(fā)痛的維持。（3）對于熱痛敏，在前給藥組中，ERK、JNK、P38抑制劑均能抑制蜂毒肽誘發(fā)原發(fā)性熱痛敏的產(chǎn)生；且在后給藥組中于蜂毒肽皮下注射2到3小時后分別在同側(cè)皮下注射ERK、JNK、P38抑制劑也能部分逆轉(zhuǎn)熱痛敏，說明這三種蛋白激酶在蜂毒肽誘發(fā)原發(fā)性熱痛敏產(chǎn)生和維

10、持的過程中發(fā)揮了作用。（4）對于機械性痛敏，無論是通過前給藥方式還是通過后給藥方式，ERK與JNK抑制劑對蜂毒肽誘發(fā)原發(fā)性機械痛敏無抑制作用，說明這兩種蛋白激酶并未參與蜂毒肽誘發(fā)原發(fā)性機械痛敏的產(chǎn)生與維持；而P38絲裂原活化蛋白激酶抑制劑對原發(fā)性機械痛敏的產(chǎn)生無抑制作用，對原發(fā)性機械痛敏的維持有部分抑制作用。（5）在對側(cè)足底局部注射這三種激酶抑制劑，對注射蜂毒肽一側(cè)足底的持續(xù)性自發(fā)痛、原發(fā)性熱和機械痛敏的產(chǎn)生和維持也無影響，這樣就排除了