骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)對腎小球足細(xì)胞mTOR的作用研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　一、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　目的：通過Ficoll密度梯度離心和貼壁分離法體外分離、培養(yǎng)適合實(shí)驗(yàn)研究的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞
　　方法：
　　1，無菌條件下取出健康雄性SD大鼠股、脛骨,采用Ficoll密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法分離純化BMSCs，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長情況。傳至P3代時(shí)，細(xì)胞計(jì)數(shù)并鑒定。
　　2.用成脂、成骨誘導(dǎo)試劑誘導(dǎo)BMSCs向成脂

2、和成骨分化，用油紅O染色檢測成脂細(xì)胞，用VonKossa染色法染色檢測成骨細(xì)胞。
　　3.用流式細(xì)胞鑒定BMSCs表面的抗原標(biāo)志物CD29、CD34、CD45、CD90。
　　結(jié)果：鏡下觀察BMSCs呈梭形、多角形成纖維細(xì)胞樣形態(tài),大小一致。BMSCs加入成骨和成脂誘導(dǎo)劑后誘導(dǎo)出成骨和成脂細(xì)胞。BMSCs流式細(xì)胞儀檢測其抗原標(biāo)志物提示CD29、CD90強(qiáng)陽性，低表達(dá)CD45、CD34，細(xì)胞純度高。
　　結(jié)論：采用Fic

3、oll密度梯度離心和體外細(xì)胞貼壁分離培養(yǎng)法相結(jié)合提取的BMSCs，穩(wěn)定性好，活性高，可以達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。
　　第二部分足細(xì)胞原代的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　目的：通過過篩法分離腎小球，胰酶消化破膜后，并進(jìn)行足細(xì)胞原代培養(yǎng)，建立穩(wěn)定的足細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，供實(shí)驗(yàn)使用。
　　方法：1.無菌條件下取出雄性S D大鼠兩側(cè)腎臟，剪碎腎皮質(zhì)后，用80目，150目，200目網(wǎng)篩分離腎小球，并用光學(xué)顯微鏡下觀察腎小球形態(tài)。
　　2.收集

4、并用Ⅳ型膠原酶消化腎小球，種植在用Ⅰ型膠原包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，5d后在在顯微鏡下觀察腎小球形態(tài)。
　　3.測定細(xì)胞表面的上neprin和WT-1抗原。
　　結(jié)果：用過篩法可分離出高純度的腎小球，并用Ⅳ型膠原酶消化后種植在培養(yǎng)瓶中3天后從腎小球中爬出成鵝卵石樣細(xì)胞，所提取的細(xì)胞經(jīng)足細(xì)胞特異性表位WT-1和nephrin鑒定為足細(xì)胞。
　　結(jié)論：用過篩法結(jié)合Ⅳ型膠原酶消化法能培養(yǎng)出細(xì)胞，經(jīng)鑒定培養(yǎng)出的細(xì)胞為符合實(shí)驗(yàn)要求足細(xì)

5、胞。
　　第三部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）對腎小球足細(xì)胞mTOR的作用研究。
　　目的：探討B(tài)MSCs對保護(hù)嘌呤霉素?fù)p傷足細(xì)胞的作用研究及哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTO R)在此過程中的表達(dá)；
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)分組：
　　正常組：足細(xì)胞；
　　嘌呤霉素組：足細(xì)胞+嘌呤霉素(5ug/ml)；
　　干細(xì)胞組：足細(xì)胞+BMSCs（共培養(yǎng)24h）+嘌呤霉素(5ug/ml)；
　　各實(shí)驗(yàn)組

6、干預(yù)3h后通過普通RT-PCR檢測nephrin mRNA和用Western-Blot技術(shù)檢測nephrin、mTOR、p-mTOR蛋白的的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1、普通人體RT-PCR電泳示：正常組、嘌呤霉素組、干細(xì)胞組nephrin mRNA的表達(dá)無明顯差異。
　　2.Western bolt結(jié)果示：正常組、嘌呤霉素組、干細(xì)胞組nephrin蛋白的表達(dá)無明顯差異；嘌呤霉素組相比正常對照組p-mTO R蛋白的表達(dá)上