SiRNA沉默抗凋亡基因Bcl-2的表達誘導人胃癌SGC-7901細胞Beclin1依賴途徑的細胞自噬的探討.pdf

1、目的:Ⅰ型程序性細胞死亡（凋亡，apoptosis）和Ⅱ型程序性細胞死亡（自噬，autophagy）在調節(jié)機體環(huán)境穩(wěn)態(tài)、疾病發(fā)展和清除惡性腫瘤細胞中發(fā)揮重要的生理和病理作用。自噬和凋亡在腫瘤中均可發(fā)揮促進腫瘤細胞生存或死亡的雙重作用，二者同為程序性細胞死亡之間存在十分復雜的聯(lián)系。凋亡分子機制的研究已相當成熟，Bcl-2蛋白家族在凋亡過程中發(fā)揮至關重要的作用，然而自噬的分子機制尚不清楚。最近研究結果顯示，作為自噬最重要的效應分子和腫瘤抑制

2、因子Beclin1最初作為抗凋亡蛋白Bcl-2的交互蛋白而被分離出來，Beclin1通過其BH3(Bcl-2-homology-3(BH3)amphipathicalpha-helix)結構域與抗凋亡蛋白Bcl-2上的BH3受體(BH3receptor)結合，而抗凋亡蛋白Bcl-2在細胞自噬中的作用有待進一步研究。研究表明，在亞洲和世界范圍內胃癌死亡率居于人類癌癥死亡率的第二位，居于中國癌癥死亡率的首位。而人胃癌SGC-7901細胞過表

3、達抗凋亡蛋白Bcl-2，本研究旨在通過干擾RNA介導的基因敲除技術，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達以揭示其在細胞自噬中的作用，為胃癌的臨床治療提供新方法，并為干擾RNA應用于臨床治療提供新的理論和實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 1應用基因轉染、RealTimeRT-PCR(realtimereversetranscriptionpolymerasechainreaction)、Western-Blot方法檢測外源性Bcl

4、-2特異性干擾RNA(Bcl-2siRNA)介導的抗凋亡因子Bcl-2轉錄后的基因沉默效應。
　　 2應用RealTimeRT-PCR、Western-Blot方法檢測Bcl-2siRNA轉錄SGC-7901細胞前后自噬效應分子Beclin1的mRNA和蛋白表達水平的變化，并分析其與抗凋亡因子Bcl-2之間的關系。
　　 3轉染Bcl-2特異性siRNA后，提取基因組DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的降解情況，

5、看其細胞是否發(fā)生凋亡。
　　 4用透射電子顯微鏡(Transmissionelectronmicroscopy，TEM)對比觀察轉染Bcl-2特異性干擾RNA(Bcl-2siRNA)組和對照siRNA(controlsiRNA)組自噬小體的變化，判斷其細胞是否發(fā)生自噬。
　　 結果:
　　 1Western-Blot結果顯示，在Bcl-2過表達的SGC-7901細胞中，轉染Bcl-2特異性siRNA(1，2，3)

6、后，抗凋亡蛋白Bcl-2表達明顯降低，其蛋白下降量分別為54％、63％、82％。RealTimeRT-PCR結果顯示轉染Bcl-2特異性siRNA-3(Bcl-2siRNA-3)后，Bcl-2的mRNA表達量顯著下降，其抑制率為98％。
　　 2Bcl-2特異性siRNA(Bcl-2siRNA)沉默抗凋亡基因Bcl-2后，RealTimeRT-PCR和Western-Blot結果均表明自噬特異性效應物Beclin1在mRNA和蛋

7、白表達水平均顯著增加，分別為70％，58％。
　　 3基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳結果表明轉染Bcl-2特異性siRNA(Bcl-2siRNA-3)后，發(fā)生非凋亡性的細胞死亡。
　　 4透射電子顯微鏡對比觀察結果顯示轉染Bcl-2特異性siRNA(Bcl-2siRNA-3)組而非對照siRNA(controlsiRNA)組細胞中形成大量雙層膜包裹未被完全降解的細胞內容物的自噬小體。
　　 結論:
　　 1B

8、cl-2特異性siRNA(Bcl-2siRNA)可有效發(fā)揮抗凋亡基因Bcl-2轉錄后的基因沉默(PTGs，post-transcriptionalgenesilencing)作用。
　　 2抗凋亡蛋白Bcl-2應用特異性siRNA沉默其表達后，可誘導人胃癌SGC-7901細胞Beclin1依賴途徑的細胞自噬。
　　 3Bcl-2特異性siRNA(Bcl-2siRNA)轉染人胃癌SGC-7901細胞后，發(fā)生的細胞死亡是自噬