靶向抑制液泡ATP酶治療骨溶解及其機制研究.pdf

1、液泡ATP酶是一個由至少14個蛋白亞單位組成的蛋白復合體,負責生物體內氫離子的跨膜轉運,在生物體內發(fā)揮重要而多樣的生理功能。在破骨細胞吸收骨質過程中,液泡ATP酶大量聚集到破骨細胞極化的皺褶緣上,通過大量氫離子的跨膜轉運,將骨吸收腔內的pH值下調至約4.5左右,開始溶解礦化的無機礦物質;與此同時,該酸性環(huán)境還能激活基質蛋白降解酶,降解骨膠原等有機礦物質,實現(xiàn)破骨細胞骨吸收功能。遺傳學研究已經證實,液泡ATP酶a3亞單位發(fā)生突變是導致50

2、％骨質硬化癥的分子基礎。因此,液泡ATP酶在破骨細胞骨吸收中發(fā)揮重要功能。
　　本研究分主要分兩部分展開:首先,我們發(fā)現(xiàn)了液泡ATP酶輔助性亞單位Ac45在破骨細胞中通過調節(jié)液泡ATP酶VO結構域的穩(wěn)定性發(fā)揮功能,闡明了Ac45在破骨細胞骨吸收過程中的分子生物學機制;其次,我們研發(fā)靶向抑制液泡ATP酶的新型化學物SaliPhe,證實了該化合物能有效抑制破骨細胞液泡ATP酶介導的骨吸收,進而有效防治磨損顆粒導致的骨溶解,為臨床治療破

3、骨細胞相關疾病提供了新的治療方法。
　　在本研究中,我們首先通過生物共振能量發(fā)光轉移法,發(fā)現(xiàn)液泡ATP酶V0結構域輔助性亞單位Ac45與a3和c''亞單位之間具有強烈的蛋白蛋白作用,提示Ac45在液泡ATP酶氫離子轉運過程中可能發(fā)揮重要作用。在此基礎上,我們深入研究,發(fā)現(xiàn)液泡ATP酶Ac45亞單位在破骨細胞內穩(wěn)定表達,并在破骨細胞骨吸收過程中通過囊泡轉運集中到皺褶緣表面。我們進一步采用基因沉默方法,發(fā)現(xiàn)Ac45對破骨細胞的骨吸收功

4、能具有決定性作用,Ac45基因沉默后液泡ATP酶所介導的細胞內酸化功能障礙,導致骨吸收受限。研究中,我們意外地發(fā)現(xiàn),Ac45對破骨細胞的縫合區(qū)形成、破骨細胞的分化和破骨細胞的融合具有重要的功能,表明Ac45在破骨細胞內發(fā)揮多樣的生物學功能。為了進一步研究液泡ATP酶在生物體內的作用,我們試圖構建破骨細胞特異性的Ac45基因敲除小鼠。然而,在Ac45基因中插入新霉素位點影響了Ac45基因的表達,導致Ac45全身性基因敲除,小鼠表現(xiàn)為胚胎致

5、死。進一步采用體外和體內蛋白表達和蛋白相互作用研究手段,我們發(fā)現(xiàn)在有效沉默Ac45基因表達后,液泡ATP酶V0結構域其他各個亞單位之間的相互作用減弱,液泡ATP酶V0結構域穩(wěn)定性下降,各個蛋白亞單位降解加快,最終導致破骨細胞功能下降(體外)和小鼠胚胎致死(體內)。我們的研究闡明了Ac45在穩(wěn)定液泡ATP酶V0結構域中的重要作用。
　　在深入分析液泡ATP酶在生物體內的分子作用機制基礎上,我們研究了新型液泡ATP酶抑制劑SaliPh

6、e在治療破骨細胞相關的骨溶解疾病中的作用。我們通過體外研究證實了液泡ATP酶抑制劑SaliPhe能有效抑制破骨細胞的骨吸收功能,其作用機制為液泡ATP酶抑制劑抑制細胞內酸化和破骨細胞縫合區(qū)形成。我們還發(fā)現(xiàn)液泡ATP酶抑制劑通過阻RANKL介導的NFkB和NFATc1信號通路,抑制了破骨細胞的分化和融合。與大量的體外分子機制研究相一致,我們的體內動物模型研究證實了液泡ATP酶抑制劑能有效抑制磨損顆粒介導的骨溶解。
　　總之,本研究深