靶向抑制液泡ATP酶治療骨溶解及其機(jī)制研究.pdf

1、液泡ATP酶是一個(gè)由至少14個(gè)蛋白亞單位組成的蛋白復(fù)合體,負(fù)責(zé)生物體內(nèi)氫離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),在生物體內(nèi)發(fā)揮重要而多樣的生理功能。在破骨細(xì)胞吸收骨質(zhì)過程中,液泡ATP酶大量聚集到破骨細(xì)胞極化的皺褶緣上,通過大量氫離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),將骨吸收腔內(nèi)的pH值下調(diào)至約4.5左右,開始溶解礦化的無機(jī)礦物質(zhì);與此同時(shí),該酸性環(huán)境還能激活基質(zhì)蛋白降解酶,降解骨膠原等有機(jī)礦物質(zhì),實(shí)現(xiàn)破骨細(xì)胞骨吸收功能。遺傳學(xué)研究已經(jīng)證實(shí),液泡ATP酶a3亞單位發(fā)生突變是導(dǎo)致50

2、％骨質(zhì)硬化癥的分子基礎(chǔ)。因此,液泡ATP酶在破骨細(xì)胞骨吸收中發(fā)揮重要功能。
　　本研究分主要分兩部分展開:首先,我們發(fā)現(xiàn)了液泡ATP酶輔助性亞單位Ac45在破骨細(xì)胞中通過調(diào)節(jié)液泡ATP酶VO結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性發(fā)揮功能,闡明了Ac45在破骨細(xì)胞骨吸收過程中的分子生物學(xué)機(jī)制;其次,我們研發(fā)靶向抑制液泡ATP酶的新型化學(xué)物SaliPhe,證實(shí)了該化合物能有效抑制破骨細(xì)胞液泡ATP酶介導(dǎo)的骨吸收,進(jìn)而有效防治磨損顆粒導(dǎo)致的骨溶解,為臨床治療破

3、骨細(xì)胞相關(guān)疾病提供了新的治療方法。
　　在本研究中,我們首先通過生物共振能量發(fā)光轉(zhuǎn)移法,發(fā)現(xiàn)液泡ATP酶V0結(jié)構(gòu)域輔助性亞單位Ac45與a3和c''亞單位之間具有強(qiáng)烈的蛋白蛋白作用,提示Ac45在液泡ATP酶氫離子轉(zhuǎn)運(yùn)過程中可能發(fā)揮重要作用。在此基礎(chǔ)上,我們深入研究,發(fā)現(xiàn)液泡ATP酶Ac45亞單位在破骨細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá),并在破骨細(xì)胞骨吸收過程中通過囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)集中到皺褶緣表面。我們進(jìn)一步采用基因沉默方法,發(fā)現(xiàn)Ac45對(duì)破骨細(xì)胞的骨吸收功

4、能具有決定性作用,Ac45基因沉默后液泡ATP酶所介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)酸化功能障礙,導(dǎo)致骨吸收受限。研究中,我們意外地發(fā)現(xiàn),Ac45對(duì)破骨細(xì)胞的縫合區(qū)形成、破骨細(xì)胞的分化和破骨細(xì)胞的融合具有重要的功能,表明Ac45在破骨細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮多樣的生物學(xué)功能。為了進(jìn)一步研究液泡ATP酶在生物體內(nèi)的作用,我們?cè)噲D構(gòu)建破骨細(xì)胞特異性的Ac45基因敲除小鼠。然而,在Ac45基因中插入新霉素位點(diǎn)影響了Ac45基因的表達(dá),導(dǎo)致Ac45全身性基因敲除,小鼠表現(xiàn)為胚胎致

5、死。進(jìn)一步采用體外和體內(nèi)蛋白表達(dá)和蛋白相互作用研究手段,我們發(fā)現(xiàn)在有效沉默Ac45基因表達(dá)后,液泡ATP酶V0結(jié)構(gòu)域其他各個(gè)亞單位之間的相互作用減弱,液泡ATP酶V0結(jié)構(gòu)域穩(wěn)定性下降,各個(gè)蛋白亞單位降解加快,最終導(dǎo)致破骨細(xì)胞功能下降(體外)和小鼠胚胎致死(體內(nèi))。我們的研究闡明了Ac45在穩(wěn)定液泡ATP酶V0結(jié)構(gòu)域中的重要作用。
　　在深入分析液泡ATP酶在生物體內(nèi)的分子作用機(jī)制基礎(chǔ)上,我們研究了新型液泡ATP酶抑制劑SaliPh

6、e在治療破骨細(xì)胞相關(guān)的骨溶解疾病中的作用。我們通過體外研究證實(shí)了液泡ATP酶抑制劑SaliPhe能有效抑制破骨細(xì)胞的骨吸收功能,其作用機(jī)制為液泡ATP酶抑制劑抑制細(xì)胞內(nèi)酸化和破骨細(xì)胞縫合區(qū)形成。我們還發(fā)現(xiàn)液泡ATP酶抑制劑通過阻RANKL介導(dǎo)的NFkB和NFATc1信號(hào)通路,抑制了破骨細(xì)胞的分化和融合。與大量的體外分子機(jī)制研究相一致,我們的體內(nèi)動(dòng)物模型研究證實(shí)了液泡ATP酶抑制劑能有效抑制磨損顆粒介導(dǎo)的骨溶解。
　　總之,本研究深