版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡介
1、目的:近年來的研究發(fā)現(xiàn),哺乳動物細(xì)胞質(zhì)膜中存在著一些脂質(zhì)組成特異、有序的局限性結(jié)構(gòu),這些膜異質(zhì)性區(qū)域被稱為“微區(qū)”(microdomain)或“脂筏” (lipid raft)。而小窩(caveolae)因?yàn)榫哂袩康仔桶枷莸男螒B(tài)和特殊的標(biāo)記蛋白小窩蛋白(caveolin)成為脂筏重要的一個(gè)亞類,與其它類型的脂筏相區(qū)別。研究表明,脂筏參與了許多細(xì)胞外信號跨膜傳遞的過程,為膜外分子與膜受體結(jié)合提供一個(gè)微環(huán)境。同時(shí)脂筏或小窩還介導(dǎo)了細(xì)菌、病
2、毒甚至細(xì)菌毒素、朊病毒等感染細(xì)胞,成為近年來微生物領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。要研究脂筏的作用,其前期工作就是分離提取純化脂筏并對其進(jìn)行鑒定。本課題組已在實(shí)驗(yàn)室成功分離脂筏,并經(jīng)鑒定證實(shí),為今后的研究工作奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。此外,本課題組選用副粘病毒科成員副流感病毒.3(HPIV-3)和新城雞瘟病毒(NDV)初步探討了脂筏與病毒感染的關(guān)系,以期為今后找到不同病毒通過脂筏入胞的共性,尋找新的抗病毒藥物靶點(diǎn),深入了解細(xì)胞內(nèi)吞的機(jī)制打下基礎(chǔ)。 方法:
3、 1、脂筏的分離提純與鑒定: 所有操作步驟均在0-4℃下進(jìn)行。對照組用15mM甲基-β-環(huán)糊精預(yù)處理,其它操作步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。兩組細(xì)胞數(shù)均約為2×10<'8>個(gè),離心收集細(xì)胞沉淀,在細(xì)胞團(tuán)中加入裂解緩沖液,混勻后用Dounce勻漿器輕打10次,再放入冰盒上裂解30min后離心,離心后的上清為去核液約1ml,向去核液中加入2ml 60﹪的OptiPrep,使其終濃度為40﹪,將以上稀釋物小心放入離心管底部,用細(xì)胞裂解緩沖
4、液稀釋OptiPrep,使其終濃度分別為30﹪、25﹪、5﹪。按從高到低的順序逐層加入到離心管中,每個(gè)梯度均為2ml。4℃下超速離心,100 000g,5h。從上到下依次收集離心樣品9份,每份約1ml,行免疫印跡分析。 2、脂筏介導(dǎo)HPIV-3和NDV入胞的初步探討(1)HPIV-3和NDV分別經(jīng)雞胚增殖后測定效價(jià),HPIV-3為1:640,NDV為1:1280。并測定兩種病毒的TCID<,50>:HPIV-3的。rCID<,50>為1
5、0<'4.2>/0.1ml:NDV的TCID<,50>為10<'5.3>/0.1ml。 (2)以CPE為指標(biāo)觀察藥物干預(yù)后病毒對細(xì)胞的感染性:分別以濃度5mmol/L、10mmol/、15mmol/L的甲基-β-環(huán)糊精37℃作用于MDCK細(xì)胞單層30min,之后以100TCID<,50>/0.1ml的HPIv-3或NDv 37℃吸附1.5h,于37℃,5﹪CO<,2>孵箱培養(yǎng)4天。每日觀察特征性細(xì)胞病變(CPE)。按統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)
6、算各組藥物處理后病毒感染細(xì)胞的百分比。 (3)以蝕斑法測定藥物干預(yù)后病毒對細(xì)胞的感染性:配制含0.75﹪瓊脂的無酚紅RPMI1640 50℃保溫備用。分別用5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L甲基-β-環(huán)糊精處理MDCK細(xì)胞單層30min,之后感染10<'5>的HPIV-3和10<'-7>NDV,37℃吸附1.5h,加第一層瓊脂,室溫固化后置37℃5﹪CO<'2>孵箱培養(yǎng)3天,第4天鋪第二層含中性紅的瓊脂培養(yǎng)基,避
7、光培養(yǎng)數(shù)小時(shí)或過夜,倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)蝕斑數(shù),并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 (4)小窩形態(tài)和NDV吸附細(xì)胞部位的電鏡觀察。 結(jié)果: 1、經(jīng)離心和免疫印跡實(shí)驗(yàn),脂筏主要位于25-30﹪密度梯度離心界面中,存在于收集樣品中的第5、6、7管。小窩蛋白-1的分子量約為24KD,而對照組第5、6、7管未發(fā)現(xiàn)小窩蛋白-1。 2、以CPE為指標(biāo)觀察藥物干預(yù)后病毒對細(xì)胞的感染性:甲基-β-環(huán)糊精對兩種病毒感染細(xì)胞均有一定抑制作用,且
8、隨著劑量的增加效果明顯提高。 3、以病毒蝕斑為指標(biāo)觀察藥物干預(yù)后病毒對細(xì)胞的感染性:經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析, 10mmol/L甲基-β-環(huán)糊精和15mmol/L甲基-β-環(huán)糊精處理后病毒感染細(xì)胞的抑制效果均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。盡管從數(shù)據(jù)上看NDV似乎更依賴脂筏進(jìn)入細(xì)胞,但兩種病毒之間對通過脂筏感染細(xì)胞的區(qū)別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4、透射電鏡下可見形態(tài)各異的凹陷狀小窩。NDV感染30分鐘,病毒吸附于細(xì)胞膜上一個(gè)小窩狀的凹陷內(nèi),
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 宿主細(xì)胞中戊型肝炎病毒衣殼結(jié)合蛋白的篩選及Grp78-Bip介導(dǎo)病毒入胞的初步研究.pdf
- 傳染性支氣管炎病毒結(jié)合脂筏并通過網(wǎng)格蛋白依賴型內(nèi)吞入胞.pdf
- DC-SIGN介導(dǎo)HCV入胞作用的研究.pdf
- 人偏肺病毒入胞機(jī)制的研究.pdf
- 脂筏、非脂筏質(zhì)膜微域內(nèi)層磷脂結(jié)構(gòu)的分析.pdf
- TNFR1的內(nèi)化與脂筏關(guān)系的探討.pdf
- 氯丙嗪對2009H1N1型流感病毒的網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞入胞途徑抑制作用的研究.pdf
- 人偏肺病毒入胞機(jī)制的相關(guān)研究.pdf
- 丙型肝炎病毒的受體研究——B族Ⅰ型清道夫受體介導(dǎo)HCV入胞作用的研究.pdf
- 副粘病毒入侵宿主細(xì)胞的機(jī)制研究.pdf
- 副粘病毒Tianjin株缺損性干擾顆粒用作新型生物佐劑的初步研究.pdf
- 脂筏特異蛋白對囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)作用的初步研究.pdf
- 脂筏相關(guān)的丙型肝炎病毒基因復(fù)制復(fù)合體的研究.pdf
- 鴨副粘病毒的致病性研究.pdf
- 囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)的動態(tài)跟蹤及其與脂筏關(guān)系的初步研究.pdf
- 對蝦白斑綜合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)入胞途徑及其分子調(diào)控機(jī)制研究.pdf
- 慢病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎的初步研究.pdf
- 禽副粘病毒Ⅰ型鴿源分離株單克隆抗體的制備和初步應(yīng)用.pdf
- 脂筏對丙型肝炎病毒、日本腦炎病毒和腸道病毒71型細(xì)胞入侵的影響及其機(jī)制研究.pdf
- 中耳膽脂瘤胞內(nèi)酪氨酸蛋白激酶途徑的研究.pdf
評論
0/150
提交評論