心肌纖維化時(shí)NAD（P）H氧化酶的研究以及丹參酮ⅡA的作用.pdf

1、第一部分不同亞型NAD(P)H氧化酶所致氧化應(yīng)激促進(jìn)兩腎兩夾高血壓大鼠心肌纖維化發(fā)展以及丹參酮Ⅱ A的抑制作用。 目的：高血壓導(dǎo)致的心肌肥大在體循環(huán)高負(fù)荷長期存在時(shí)，會(huì)發(fā)生失代償，出現(xiàn)充血性心力衰竭，增加死亡率。 方法：采用兩腎兩夾法(two-kidney two-clip，2K2C)建立腎血管性高血壓大鼠模型。術(shù)后4周篩選出符合要求的高血壓大鼠開始給藥。實(shí)驗(yàn)共分5組，每組15只大鼠：(1)對照組(Sham)：假手術(shù)大鼠

2、，每天灌胃給與等量的0.5﹪羧甲基纖維素鈉；(2)模型組(2K2C)：2K2C手術(shù)的高血壓大鼠，每天灌胃給與等量的0.5﹪羧甲基纖維素鈉；(3)纈沙坦組(Val)：2K2C手術(shù)的高血壓大鼠，每天灌胃給與60 mg/kg劑量的纈沙坦；(4)丹參酮Ⅱ A高劑量組(TanH)：2K2C手術(shù)的高血壓大鼠，每天灌胃給與70 mg/kg的丹參酮ⅡA；(5)丹參酮ⅡA低劑量組(TanL)：2K2C手術(shù)的高血壓大鼠，每天灌胃給與35 mg/kg的丹參酮

3、ⅡA。每周測體重，按體重調(diào)整用藥劑量，共給藥6周。 結(jié)果： 1.2K2C手術(shù)后SD大鼠血壓穩(wěn)定增高，4周后達(dá)到180 mmHg以上，10周后血壓穩(wěn)定在187 mmHg左右；血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)左心室收縮壓峰值(LVSP)、左心室舒張末期壓(LVEDP)、左心室等容收縮期壓力上升和下降最大速率(+dp/dtmax)和心率(HR)都明顯升高；超聲心動(dòng)圖參數(shù)收縮末期左室內(nèi)徑(LVDs)、收縮末期室間隔厚度(IVSs)、舒張末期室間隔

4、厚度(IVSd)、收縮末期左室后壁厚度(PWs)、舒張末期左室后壁厚度(PWd)都明顯增大，而舒張末期左室內(nèi)徑(LNDd)、射血分?jǐn)?shù)(EF)、左室收縮分?jǐn)?shù)(LVFS)明顯減??；左心室重量與體重比值(LVW/BW)明顯增大；Masson染色顯示心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)和血管周圍膠原面積(PVCA)都明顯增大，羥脯氨酸試劑盒檢測到心室肌膠原含量明顯升高，這些指數(shù)說明2K2C大鼠10周后發(fā)展有高血壓并伴有明顯的心肌肥大、纖維化和心臟收縮舒張

5、功能障礙； 2.丙二醛(MDA)試劑盒顯示2K2C高血壓大鼠心肌中MDA濃度顯著升高；共聚焦顯微鏡和化學(xué)發(fā)光法檢測到2K2C大鼠的心室肌和主動(dòng)脈中O<,2><'·->產(chǎn)生明顯增多，說明存在明顯的氧化應(yīng)激； 3.化學(xué)發(fā)光法檢測到2K2C大鼠的心室肌和主動(dòng)脈中NAD(P)H氧化酶活性明顯增強(qiáng)，心室肌主要利用NADH為底物，主動(dòng)脈可以利用NADH和NADPH作為底物；Westen Blot和RT-PCR方法顯示NAD(P)H氧

6、化酶催化亞基p47phox的蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)錄都明顯增高； 4.Nox不同亞型在2K2C大鼠的心室肌和主動(dòng)脈中的表達(dá)變化不同，心室肌中Nox2和Nox4的蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)錄明顯升高，而主動(dòng)脈中Noxl和Nox4增高； 5.給與6周的纈沙坦和丹參酮ⅡA治療后，發(fā)現(xiàn)纈沙坦有效降低血壓和LVSP，而高低劑量的丹參酮ⅡA都對血壓和INSP沒有明顯影響；但纈沙坦和高劑量的丹參酮Ⅱ A都能明顯減小2K2C高血壓大鼠的LNEDP、+dp/dt

7、max、LVDs、IVSs、IVSd、PWs、PWd，增大LNDd、EF、INFS，降低LVW/BW、CVF、PVCA和心室肌膠原含量，低劑量的丹參酮Ⅱ A也能改善部分參數(shù)，但效果略差于高劑量的，這些說明纈沙坦能降低高血壓并減輕其伴有的心肌肥大、纖維化和心臟收縮舒張功能障礙，丹參酮Ⅱ A顯示不依賴降低高血壓的減輕心肌肥大、纖維化和心臟收縮舒張功能障礙的作用； 6.纈沙坦和丹參酮Ⅱ A都能明顯降低2K2C高血壓大鼠心肌中MDA濃度

8、、減少心室肌和主動(dòng)脈中O<,2><'·->產(chǎn)生、降低NAD(P)H氧化酶活性、減少催化亞基p47phox的蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)錄； 7.但對不同Nox亞基，纈沙坦和丹參酮ⅡA表現(xiàn)出不同的選擇性抑制作用，纈沙坦降低心室肌和主動(dòng)脈中的Nox1、Nox2、Nox4的蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)錄，而丹參酮Ⅱ A只降低Nox2、Nox4的蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)錄，對Noxl的變化沒有明顯的影響。高劑量的丹參酮Ⅱ A表現(xiàn)出比低劑量強(qiáng)的改善作用。 結(jié)論： 1

9、．2K2C高血壓大鼠發(fā)展有明顯的心肌肥大、纖維化和心臟收縮舒張功能障礙，心室肌和主動(dòng)脈中NAD(P)H氧化酶活性增強(qiáng)導(dǎo)致的O<,2><'·->產(chǎn)生過多在上述病理發(fā)展過程中起重要作用； 2．心室肌和主動(dòng)脈中NAD(P)H氧化酶的底物選擇性不同，這可能和NAD(P)H氧化酶催化亞基Nox家族的不同亞型在心室肌和主動(dòng)脈中的表達(dá)以及在病理?xiàng)l件下的變化的不同有關(guān)； 3．纈沙坦通過降低心室肌和主動(dòng)脈中的Nox1、Nox2、Nox4的

10、蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)錄、降低NAD(P)H氧化酶活性、減少O<,2><'·->產(chǎn)生等作用，產(chǎn)生降低高血壓并減輕其伴有的心肌肥大、纖維化和心臟收縮舒張功能障礙等效應(yīng)； 4．丹參酮ⅡA通過降低Nox2、Nox4．的蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)錄、降低NAD(P)H氧化酶活性、減少O<,2><'·->產(chǎn)生等作用，產(chǎn)生延緩心肌肥大、纖維化和心臟收縮舒張功能障礙等發(fā)展的效應(yīng)，但對Nox1的變化和血壓的升高沒有明顯的影響； 5．心肌肥大、纖維化和心臟收縮舒

11、張功能障礙等發(fā)展和血壓的升高可能與不同Nox亞基介導(dǎo)的NAD(P)H氧化酶激活有關(guān)。 第二部分過氧化氫通過增強(qiáng)NAD(P)H氧化酶所致的氧化應(yīng)激促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞膠原合成以及丹參酮Ⅱ A的抑制作用。 目的：血管NAD(P)H氧化酶激活產(chǎn)生的活性氧增多形成的氧化應(yīng)激在心肌纖維化發(fā)展過程中起重要作用。 方法：應(yīng)用<'3>H標(biāo)記的脯氨酸和胸腺嘧啶摻入法測定H<,2>O<,2>對心臟成纖維細(xì)胞膠原合成和增殖的影響，以及丹

12、參酮Ⅱ A的作用；用流式細(xì)胞儀和共聚焦顯微鏡檢測DHE氧化產(chǎn)物的熒光以測定O<,2><'·->產(chǎn)生；用化學(xué)發(fā)光法測定NAD(P)H氧化酶活性；應(yīng)用Western Blot和PCR方法檢測NAD(P)H氧化酶的催化亞基Nox家族的不同亞型Nox2、Nox4和調(diào)節(jié)亞基p47phox的蛋白表達(dá)和mRNA轉(zhuǎn)錄的變化。 結(jié)果： 1.1、10、100u M濃度的H<,2>O<,2>表現(xiàn)出濃度依賴性增加<'3>H標(biāo)記的脯氨酸摻入量，表

13、明促進(jìn)膠原合成；而1和10 μ M濃度的H<,2>O<,2>對細(xì)胞增殖無明顯影響，100 μ M濃度時(shí)表現(xiàn)抑制細(xì)胞增殖的作用；10 μ M濃度的NAD(P)H氧化酶抑制劑DPI能明顯抑制100 μ M濃度的H<,2>O<,2>的促膠原合成的作用，說明H<,2>O<,2>促進(jìn)膠原合成的作用與NAD(P)H氧化酶的激活有關(guān)。100 μ M濃度的H<,2>O<,2>促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)FN的合成分泌。 2.1、10、100 μ M濃度的H<

14、,2>O<,2>濃度依賴性地增加O<,2><'·->產(chǎn)生，加入NADH和NADPH后比加入前O<,2><'·->產(chǎn)生增多，這說明利用NADH和NADPH兩種底物的NAD(P)H氧化酶活性增強(qiáng)，并呈H<,2>O<,2>濃度依賴性。100 μ M濃度的H<,2>O<,2>刺激心臟成纖維細(xì)胞的NAD(P)H氧化酶活性增強(qiáng)，包括利用NADH和NADPH兩種底物的酶，但酶更傾向于利用NADH為底物；100 μ M濃度的H<,2>O<,2>刺激NA

15、D(P)H氧化酶催化亞基不同Nox亞型和調(diào)節(jié)亞基p47phox的蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴性增高，p47phox在3h達(dá)峰值， Nox2在1h達(dá)高峰， Nox4在3h達(dá)高峰，之后表達(dá)都持續(xù)增高。 3.丹參酮Ⅱ A劑量依賴性抑制100 μ M濃度的H<,2>O<,2>促進(jìn)的心肌成纖維細(xì)胞膠原增殖；0.1和1 μ M濃度的丹參酮ⅡA對100μ M的H<,2>O<,2>的抑制增殖的作用表現(xiàn)改善作用，而10 μ M濃度的丹參酮ⅡA對細(xì)胞增殖表現(xiàn)

16、更明顯的抑制。1 μM濃度的丹參酮ⅡA和10μ M的DPI都能明顯抑制H<,2>O<,2>的促進(jìn)作用。 4.1 μ M濃度的丹參酮ⅡA明顯減少100μ M濃度的H<,2>O<,2>刺激增加的O<,2><'·->的產(chǎn)生，也減少加入NADH和NADPH后H<,2>O<,2>刺激增加的O<,2><'·->的產(chǎn)生，降低幅度與DPI的作用程度相類似，這說明丹參酮Ⅱ A能抑制利用NADH和NADPH兩種底物的NAD(P)H氧化酶活性的增強(qiáng)。

17、1 μ M濃度的丹參酮ⅡA和10 μ M的DPI都能顯著降低NAD(P)H氧化酶活性，DPI的抑制效果更明顯些。1 μ M濃度的丹參酮ⅡA能顯著抑制100 μ M濃度的H<,2>O<,2>在作用3小時(shí)后明顯刺激的心臟成纖維細(xì)胞的p47phox、Nox2和Nox4的蛋白表達(dá)和mRNA轉(zhuǎn)錄。 結(jié)論： 1.H<,2>O<,2>通過刺激Nox2和Nox4依賴的NAD(P)H氧化酶的激活，增加的O<,2><'·->的產(chǎn)生，濃度依賴