麝黃消瘤方抗肝癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:本課題在原有體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，繼續(xù)研究麝黃消瘤方(SH方)在體外對肝癌細(xì)胞SMMC-7721侵襲黏附能力的影響及其可能的作用機(jī)制。重點(diǎn)探討SH方對肝癌細(xì)胞與纖維連接蛋白(FN)侵襲黏附的抑制作用，及SH方對肝癌細(xì)胞內(nèi)抑癌基因nm23-H1蛋白和細(xì)胞膜表面粘附分子(ICAM-1)表達(dá)的影響，以更好的為臨床應(yīng)用及新藥開發(fā)提供客觀科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法:(1)含藥血清的制備麝黃消瘤方由丹參、白術(shù)、半枝蓮、莪術(shù)等中藥組成，經(jīng)我院中

2、藥實(shí)驗(yàn)室水煎、濃縮、醇沉制成，臨用時用PBS稀釋成含生藥2g/ml的中藥液，雄性新西蘭大白兔6只，體重2.5kg±0.1kg，分2組，每組3只，中藥組予每只20ml/d中藥液灌胃，對照組予PBS液每只20ml/d灌胃，連續(xù)5d，從第4d下午開始禁食，d5時先灌服半量，2h后再灌服余半量，再過1h后頸總動脈取血，無菌分離血清，經(jīng)56℃30min滅活處理后，用0.22um微孔濾膜過濾除菌，以中藥兔血清，對照兔血清分別配成含血清10％的PRM

3、I1640培養(yǎng)液，-20℃保存?zhèn)溆谩?(2)細(xì)胞生長與細(xì)胞抑制率測定將2.5×104SMMC-7721肝癌細(xì)胞株分別接種于含10％中藥兔血清和10％對照兔血清的1640培養(yǎng)基中，1～7天每天計數(shù)細(xì)胞濃度，繪制細(xì)胞生長曲線。1，3，5，7天均以相同細(xì)胞數(shù)4×103/孔接種96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)3個復(fù)孔.MTT法計數(shù)1，3，5，7天的細(xì)胞數(shù)量，以光密度OD570nm表示。腫瘤細(xì)胞抑制率=(對照組平均OD570nm-中藥組平均OD570

4、nm)/對照組平均OD570nm×100％. (3)細(xì)胞膜表面ICAM-1表達(dá)測定細(xì)胞傳代后換用中藥兔血清和對照兔血清1640培養(yǎng)基分別培養(yǎng)72小時，以0.25％胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞制成懸液，離心，PBS洗滌，加入鼠抗人ICAM-1單抗30ul，冰上孵育30min后，加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗20ul，4℃孵育30min。FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測閃爍計數(shù)值。 (4)免疫組化法檢測細(xì)胞nm23-H1水平的變

5、化細(xì)胞涂片于6孔板中的玻璃片上，分別以中藥血清與對照血清培養(yǎng)72小時，4％多聚甲醛固定，30％H2O2+純甲醇滅活內(nèi)源性過氧化物酶，BSA封閉，滴加1：200稀釋一抗，再依次加二抗、SABC、DAB顯色、蘇木素輕度復(fù)染，脫水、透明、封片固定。用已知陽性染色的肝癌切片為每次實(shí)驗(yàn)的陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。 (5)肝癌細(xì)胞對FN的侵襲粘附試驗(yàn)將8MMC-7721細(xì)胞懸液接種于FN包被的6孔培養(yǎng)板上，用含10％小牛血清的1

6、640培養(yǎng)至細(xì)胞長滿后，在孔底刮出一條2mm寬的無細(xì)胞帶，洗去多余的細(xì)胞，分別改用中藥組血清和對照組血清培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，貼壁情況和刮痕寬度變化，記錄12h、24h、36h時以上狀況。 (6)MTT定量測定肝癌細(xì)胞與FN的粘附4×105/ml的細(xì)胞接種于FN包被的96孔培養(yǎng)板，100ul/孔，分別設(shè)中藥血清，對照血清組培養(yǎng)，增設(shè)無細(xì)胞有藥物組作陰性對照組。加入培液100ul/孔，每組設(shè)計4個復(fù)孔。置37℃，CO25％培養(yǎng)箱

7、內(nèi)培養(yǎng)，10min，20min，40min，60min時按時間分類組分別用PBS洗去未粘附的細(xì)胞，每孔加20ul的濃度為5mg/ml的MTT，置培養(yǎng)箱內(nèi)4小時后，傾去液體，加入DMSO150ul/孔，在震蕩儀上輕輕震蕩使甲替顆粒融解為紅紫色溶液，上酶標(biāo)儀，光密度570nm處測OD值，OD值代替粘附細(xì)胞數(shù)作統(tǒng)計分析。 結(jié)果:(1)SMMC-7721細(xì)胞生長285繁殖力隨時間變化是逐漸上升，在第4～6天最為明顯。中藥血清組較對照組明

8、顯抑制肝癌細(xì)胞的體外生長，1，3，5，7天平均抑制率分別為10.84％(p＞0.05)、35.97％(p＜0.01)、66.25％(p＜0.01)、30.20％(p＜0.05)，其中在第5天最突出，抑制率最高達(dá)66.25％； (2)在粘附分子-1的流式細(xì)胞儀檢測中，對照組閃爍計數(shù)值共為1818.7，中藥血清組數(shù)值為1027.7，相對對照組減少43.49％； (3)在中藥血清組培養(yǎng)的SMMC-7721細(xì)胞，其抑癌基因nm2

9、3-H1陽性表達(dá)率為88.89％，對照組陽性率僅11.11％，表明中藥血清組有顯著提高抑癌基因表達(dá)的能力； (4)中藥血清組細(xì)胞在FN包被的培養(yǎng)孔中粘附力較對照組低，在劃痕處細(xì)胞分化脫落向無細(xì)胞帶侵襲生長能力較對照組弱； (5)在細(xì)胞粘附力的測定中，中藥血清組在10、20、40與60分鐘的細(xì)胞粘附抑制率分別為20.45％、26.85％、44.78％與43.12％，中藥血清組對SMMC-7721細(xì)胞在FN上的粘附抑制作用在