感染性疾病及免疫學檢測

1、常見病毒性傳染病及其免疫學檢測,平頂山市婦幼保健院,傳染?。菏遣≡w以某種方式進入到人體后，并在人體內(nèi)生長繁殖，釋放毒素或?qū)е聶C體內(nèi)微生態(tài)平衡失調(diào)，給人體的組織和器官造成一定的損傷而引起的疾病。,,病原體,易感人群,免疫學檢驗主要用于：,輔助診斷及鑒別診斷,判斷療效及預后,流行病學調(diào)查,常用的免疫學檢測方法,酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）金標法（試紙條、試紙板）化學發(fā)光法 1.電化學發(fā)光（羅氏） 2.微粒子化學發(fā)光

2、（雅培）免疫印跡法 (Western blotting)  凝集反應（梅毒檢測),酶聯(lián)免疫吸附試驗ELISA（enzyme linked immunosorbent assay） 是一類常用的免疫酶技術(shù)。是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應在固相表面進行。常用的酶：辣根過氧化物酶(HRP) 堿性磷酸酶（AP）。,基本步驟,包被封閉孵育洗滌顯色結(jié)果測定

3、 缺點：1只是診斷的輔助手段，特異性和靈敏性有待提高。2操作過程有些繁瑣，反應時間過長，不能一蹴而就。,金標法,原理：金標層析法采用雙抗原夾心法免疫測定原理，選擇經(jīng)純化的基因工程制備的抗原，分別作為包被抗原和膠體金結(jié)合抗原。由于層析作用反應復合物沿硝酸纖維膜向前移動，當遇到包被抗原時，形成紅色沉淀線。在包被膜上還有一條質(zhì)控線對照，故當有兩條紅線時判為陽性，只有一條紅線時，判為陰性。,免疫印跡法,免疫印跡法 (Western

4、blotting) 是一種將高分辨率凝膠電泳和免疫化學分析技術(shù)相結(jié)合的雜交技術(shù)。免疫印跡法具有分析容量大、敏感度高、特異性強等優(yōu)點，是檢測蛋白質(zhì)特性、表達與分布的一種最常用的方法。（病毒學檢測主要用于檢測HIV抗原確證試驗）,凝集反應,凝集反應是指顆?？乖c相應抗體結(jié)合反應出現(xiàn)的可見性現(xiàn)象。顆?？乖缤暾募毦⒓t細胞等與相應抗體相混合，在一定條件下出現(xiàn)凝集。,化學發(fā)光免疫分析chemiluminescence immunoassay

5、（ CLIA）,CLIA是將化學發(fā)光分析和免疫反應相結(jié)合而建立的一種新的免疫分析技術(shù)。這種方法兼有發(fā)光分析的高靈敏度和抗原抗體反應的高度特異性。,CLIA優(yōu)越性,高度敏感，可達pg／ml或pmol水平；特異性強，重復性好，CV＜5％。測定范圍寬，可達7個數(shù)量級。試劑穩(wěn)定，無毒害，無污染，有效期長，達數(shù)月甚至數(shù)年。操作簡單，耗時短，易于自動化。在對環(huán)保很重視的國家，CLIA成了取代RIA的首選方法。,常見術(shù)前檢測,甲型肝炎抗體

6、（抗HAV IgM）乙肝五項丙型肝炎抗體 （抗HCV)梅毒螺旋體抗體人類免疫缺陷病毒抗體（抗HIV）,病毒性肝炎,Viral Hepatitis是由一組嗜肝病毒引起的，以肝臟炎癥和壞死病變?yōu)橹鞯囊环N傳染病。主要表現(xiàn)為明顯的消化道癥狀、全身疲乏無力，肝臟腫大。肝功能異常，部分病例出現(xiàn)黃疸。,甲型病毒性肝炎（HAV）,HAV屬小RNA病毒，為正單鏈RNA病毒。HAV主要經(jīng)糞-口途徑傳播。潛伏期平均28天。HAV抵抗力較強，60℃加

7、熱10-12h后仍具有感染性，85 ℃加熱立即滅活，對乙醚、氯仿及PH為3的酸性環(huán)境有抵抗力。,HAV,,IgM：近期感染HAV,發(fā)病2周后陽性 率為100%，3個月后轉(zhuǎn)陰。早期診斷。,IgG：急性感染后6個月達高峰，然后逐漸下降，可終身存在。既往感染HAV,RNA：早期診斷的特異性指標,,HBV (hepatitis B virus）乙型肝炎病毒,,我國流行現(xiàn)狀,現(xiàn)有HBV感染者約1.6億,,HBV顆粒,管型,小球型,大球型,,H

8、BV特點,HBsAg與HBsAb,HBeAg與HBeAb,HBcAg與HBcAb,有包膜雙股DNA病毒,三組Ag-Ab系統(tǒng)：,,,,HBs-Ag,是感染的標志,見于體液和分泌物中，也可見于唾 液、精液、乳汁中,介導病毒結(jié)合肝細胞,HBs-Ab,3-6個月產(chǎn)生,有抵抗力的標志,阻斷病毒結(jié)合肝細胞,,,HBeAg,病毒復制的標志，傳染性強,病毒合成后釋放到血液中,治療的參考指標,HBeAb,病毒復制減少的標志，傳染性弱,要先于HBs

9、Ab出現(xiàn),,,HBcAg,存在于病毒核心，不釋放至血液,抗原性強,HBcAb,出現(xiàn)早，消退晚,IgM: 近期感染HBV,IgG: 既往感染HBV,臨床組合模式,乙肝五項少見模式分析,單一HBsAg： 主要見于急性HBV感染的最早期，一般隨之出現(xiàn)HBeAg和IgM的Anti-HBc。通常的慢性HBV感染中，HBsAg和Anti-HBc并存者約占95%，HBV慢性感染中不出現(xiàn)Anti-HBc是少見的。單一的HBsAg的異常表現(xiàn)主要由

10、于Anti-HBc的缺失。,HBsAg和Anti-HBs并存：在HBV感染恢復期中約有3%的個例可同時檢出HBsAg和Anti-HBs,然后HBsAg消失而Anti-HBs水平逐漸升高。在慢性HBV感染者中約3%-5%兩者共存，出現(xiàn)Anti-HBs并不表明HBsAg的清除和感染的恢復，可能由于：1.前后感染兩種亞型HBV，或HBsAg與其抗體之間僅有低親和性反應；2.S基因變異，其編碼的HBsAg抗原性改變，原型Anti-HBs不

11、能將其清除；3.α 干擾素治療中出現(xiàn)Anti-HBs血清轉(zhuǎn)換，也因S基因的變異，而未能清除HBsAg。4.HBV疫苗接種者中也有少數(shù)個例雖有正常的Anti-HBs應答，但仍能感染α決定簇變異的免疫逃逸病毒株，從而出現(xiàn)與HBsAg共存的現(xiàn)象。,HBeAg和Anti-HBe并存： 一般是處于乙肝e抗原和e抗體轉(zhuǎn)換時期，e抗原和e抗體以抗原抗體復合物的狀態(tài)共存。Anti-HBe試劑檢測時，血樣中的抗原抗體復合物同樣可以結(jié)合至包被

12、板上，起到了競爭效果。,呈世界性分布,極易慢性化，與肝硬化、原發(fā)性肝癌 關(guān)系密切,HCV （hepatitis C virus）丙型肝炎病毒,,HCV特點,有包膜的單股正鏈RNA病毒,抗HCV抗體非保護性抗體,輸血和非腸道途徑傳播,,主要檢測IgG,丙型病毒性肝炎(HCV)臨床意義,HCV是輸血后肝炎和散發(fā)性非甲非乙型肝炎的主要病原。HCV感染后可導致慢性肝炎、肝硬化和肝細胞癌等多種肝臟疾病?？笻CV陽性而血清中沒有HCV RNA提

13、示既往感染。,檢測方法,常用檢測方法為ELISA法，金標記免疫層析法和化學發(fā)光法。,檢測方法：,ELISA,化學發(fā)光,HIV (Human Immunodeficiency Virus)人獲得性免疫缺陷病毒,我國歷年艾滋病病毒感染者和病人數(shù),HIV的結(jié)構(gòu)特點,,HIV-1和HIV-2,逆轉(zhuǎn)錄病毒,兩股相同的正鏈RNA,,,,CD4+ 細胞,HIV gp120 結(jié)合CD4 / 輔助受體,病毒經(jīng)黏膜或皮膚破損進入體內(nèi)感染黏膜或皮膚層樹突

14、狀細胞病毒于24小時內(nèi)在樹突狀細胞繁殖病毒于24-28小時到達局部淋巴結(jié)病毒于5天內(nèi)出現(xiàn)在外周血液中每個感染細胞可產(chǎn)生5000個病毒顆粒，每人每天可產(chǎn)1010病毒。,HIV的檢測,篩選試驗：敏感性高，如ELISA，膠體金標記層析法。,確診試驗：特異性高，如蛋白印跡試驗和IFA,抗體最早在感染后二周，最晚三個月會轉(zhuǎn)為陽性,初篩試驗2次陽性，再進行確認試驗,,結(jié)果判斷,確診試驗陽性，有臨床癥狀，診斷為AIDS,確診試驗陽性，無臨床癥

15、狀，診斷為HIV感染者,,確診試驗陰性，但初篩試驗陽性或有臨床癥狀， 3個月后復查,,梅 毒 syphilis,是梅毒螺旋體引起的一種慢性傳染病，本病的特點是病程的長期性和潛匿性，病原體可侵犯任何器官，臨床表現(xiàn)出各種不同的癥狀。,三個階段,一期梅毒：硬性下疳； 二期梅毒：梅毒疹； 三期梅毒：累及心、肝、神經(jīng)系統(tǒng)、骨等。,后天性梅毒（獲得性）： 95%性交 傳播，少數(shù)因輸血、接吻、醫(yī)務人員不慎受染

16、等直接接觸傳播。 先天性梅毒（胎傳梅毒）： 梅毒螺旋體可自患病母體的血液經(jīng)胎盤傳給胎兒,傳播方式,非梅毒螺旋體抗原血清試驗：是以心磷脂、卵磷脂及膽固醇作為抗原檢查血清中的反應素，用于初篩試驗及療效觀察?？梢苑譃橐韵滤姆N試驗，原理基本相同： 1、性病研究實驗室玻片試驗（VDRL) ：由于試劑需現(xiàn)配 現(xiàn)用，故而國內(nèi)實驗室很少采用。但VDRL是唯一可用于神經(jīng)性梅毒診斷的血清學方法 2、快速血漿反應素環(huán)狀卡片試驗 (RPR)

17、：在特制的紙片 上進行，加入一定量特制的炭粉，可使抗原抗體出現(xiàn) 凝集，用肉眼可觀察結(jié)果。 3、甲苯胺紅試驗（TRUST)：在試劑中加入甲苯胺紅代替炭粉 顆粒，使結(jié)果更易于觀察。 4、不加熱血清反應素試驗（USR),梅毒的血清學試驗（一）,RPR,TRUST,VDRL,非梅毒螺旋體抗原血清學試驗結(jié)果判斷,滴度：出現(xiàn)凝集反應的血清最高稀釋倍數(shù)。,非梅毒螺旋體抗原血清試驗的缺陷： 1、特異

18、性：由于在多種疾病，如急性病毒性感染、自身免疫 性疾病、結(jié)締組織病、靜脈吸毒者以及懷孕婦女中均可出現(xiàn)反應素，所以此類試驗有時會出現(xiàn)假陽性反應. 2、敏感性：非梅毒螺旋體抗原血清試驗有時出現(xiàn)弱陽性或陰性結(jié)果，而臨床上又像二期梅毒，此時應將此血清稀釋后做定量試驗，如出現(xiàn)陽性結(jié)果，則為抗體過量引起的前帶現(xiàn)象。1－2％二期梅毒病人可出現(xiàn)此現(xiàn)象而發(fā)生梅毒血清假陰性反應。此外，由于感染梅毒后反應素的出現(xiàn)晚于特異性梅毒螺旋體抗體，晚期梅毒反應素又

19、可能轉(zhuǎn)陰，因此這類試驗不適于一、三期梅毒，對隱性梅毒和神經(jīng)梅毒也不敏感。因此此類試驗做梅毒初篩時，存在一定數(shù)量的漏檢.非梅毒螺旋體抗原血清試驗的優(yōu)點： 1、非梅毒螺旋體抗原血清試驗表現(xiàn)為滴度隨療程逐漸下降，故可以作為療效觀察的指標 2、此類方法價格低廉,梅毒的血清學試驗（二）,梅毒螺旋體抗原血清試驗：用梅毒螺旋體作為抗原檢測血清中的抗螺旋體IgM和/或IgG抗體，其敏感性和特異性均較高。常用的有以下五種方法： 1、熒光梅毒

20、螺旋體抗體吸收試驗（FTA-ABS) 2、梅毒螺旋體血球凝集試驗（TPHA） 3、梅毒螺旋體明膠凝集試驗（TPPA) 4、梅毒螺旋體酶聯(lián)免疫吸附試驗（TP-ELISA） 5、梅毒螺旋體快速診斷試驗（TP-RT）,梅毒的血清學試驗（三）,梅毒螺旋體明膠凝集試驗（TPPA） 原理： TPPA的原理與TPHA基本相同，它以人工合成的 惰性明膠顆粒代替TPHA試驗的紅細胞作為載體，

21、 是TPHA的升級產(chǎn)品 優(yōu)點： 1、試劑穩(wěn)定，批間差小 2、結(jié)果判讀更為清晰明確 3、敏感性和特異性較TPHA進一步提高 4、通過了國家的批批檢 不足：結(jié)果判定主觀，較難實現(xiàn)自動化,梅毒的血清學試驗（四）,賽樂迪亞（Serodia）TPPA 梅毒螺旋體抗體明膠顆粒凝集試驗,梅毒螺旋體酶聯(lián)免疫試驗（TP-ELISA）

22、 原理：以梅毒螺旋體抗原包被聚丙乙烯板，再加入待檢 血清以及酶標抗原，形成雙抗原夾心，同時檢測 IgG、IgM抗體。少數(shù)試劑采用間接法，檢測IgG 優(yōu)點：1、敏感性和特異性較高 2、價格較低，適合于對大量樣品的篩查 不足：各家ELISA試劑盒采用的抗原和工藝不同，使測 定的敏感性和特異性產(chǎn)生較大的差異，臨床實驗

23、 室在選用ELISA試劑前應認真進行評估,梅毒的血清學試驗（五）,梅毒螺旋體快速診斷試驗（TP-RT） 原理：雙抗原夾心免疫層析試驗或間接法免疫滲濾試驗， 多采用膠體金進行標記，同時檢測IgG、IgM抗體 （雙抗原夾心法）或單測IgG抗體（間接法） 優(yōu)點：1、簡便、快速，不需要特殊的儀器 2、適合于單人份操作，可用于

24、較緊急的場合 不足：1、臨床評估資料不多，敏感性、特異性尚有待進 一步考查 2、無法實現(xiàn)自動化，結(jié)果判斷主觀 3、測定結(jié)果受溫度和時間的影響較大 4、未通過國家的批批檢,梅毒的血清學試驗（六）,梅毒免疫層析快速檢測方法,,結(jié)果及意義━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 非特

25、異 特異性 意義 RPR TP━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ － 　　　 － 　 排除梅毒　＋　　　?。　》翘禺惛腥?，如麻風,SLE ＋ 　　　 ＋　 梅毒感染?。　　　。?　 梅毒經(jīng)治療后━━━━━━━━━━━━━━━━━━,梅毒抗體檢測的臨床意義,1.TRUST適用于篩查和治療效果的監(jiān)測，梅毒螺旋體抗原試驗(ELISA、