虎杖和歐亞旋覆花的組織培養(yǎng)及其活性成分的代謝調(diào)控研究.pdf

1、第一部分
　　 虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.)為蓼科多年生草本植物，在我國(guó)廣泛分布于秦嶺以南地區(qū)，根或根莖入藥?；⒄戎兴陌邹继J醇和虎杖苷具有抗癌以及治療心血管疾病等多種藥理活性，有著重要的理論研究和應(yīng)用開(kāi)發(fā)價(jià)值，受到醫(yī)藥界的廣泛重視。目前，白藜蘆醇和虎杖苷市售產(chǎn)品主要依靠從野生植物中提取，極易造成資源匱乏。為了有效地保護(hù)虎杖野生自然資源，滿足白藜蘆醇和虎杖苷在臨床應(yīng)用上的大量需求

2、，本論文在前期工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步針對(duì)虎杖組織培養(yǎng)、活性成分含量測(cè)定以及代謝調(diào)控等方面開(kāi)展了深入研究，主要結(jié)果如下：
　　 1 完善了虎杖無(wú)性快速繁殖體系
　　 應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)，進(jìn)一步完善了人工快速繁殖虎杖的方法，以組培苗幼莖為起始材料，經(jīng)過(guò)叢生芽誘導(dǎo)途徑，可在短期內(nèi)獲得大量生長(zhǎng)健壯的植株。其中，誘導(dǎo)叢生芽適宜的培養(yǎng)基為MS+0.07mg/L TDZ+0.1mg/L NAA+0.5[％]活性炭；快速生根培養(yǎng)基為MS+1

3、.0mg/L NAA+0.5[％]活性炭；壯苗培養(yǎng)基為MS+0.05mg/L PP333+0.5[％]活性炭。
　　 2 優(yōu)化了虎杖苷和白藜蘆醇含量測(cè)定方法
　　 對(duì)采用RP-HPLC檢測(cè)虎杖組培物中虎杖苷和白藜蘆醇的含量方法進(jìn)行了優(yōu)化。方法學(xué)研究表明：虎杖苷在7.64～76.4μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y=85.9x-11.1，r=0.9998；白藜蘆醇在4.02～40.2μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系

4、良好，回歸方程為y=149x-36.1，r=0.9998；虎杖苷和白藜蘆醇精密度試驗(yàn)的RSD分別為1.7[％]和1.5[％]；0～12h穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD分別為1.2[％]和2.0[％]；重復(fù)性試驗(yàn)的RSD分別為1.1[％]和1.0[％]；虎杖苷和白藜蘆醇的平均回收率分別為100.4[％]和99.4[％]，RSD分別為2.1[％]和1.6[％]。按虎杖苷峰計(jì)算理論塔板數(shù)約為8000，虎杖苷和白藜蘆醇與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5。采用

5、優(yōu)化后的方法進(jìn)行檢測(cè)，縮短了出峰時(shí)間，且無(wú)拖尾現(xiàn)象。該方法準(zhǔn)確可靠，適用于組培物的測(cè)定。
　　 3 開(kāi)展了虎杖組培苗中白藜蘆醇及虎杖苷的代謝調(diào)控研究
　　 3.1 微量元素缺失脅迫對(duì)白藜蘆醇及虎杖苷積累的影響
　　 實(shí)驗(yàn)考察了在由于微量元素缺失而造成的營(yíng)養(yǎng)脅迫環(huán)境中，虎杖組培苗不同部位累積虎杖苷和白藜蘆醇的情況。結(jié)果顯示：微量元素遞減到600μL/L時(shí)，有利于葉片部位積累較多的白藜蘆醇，其含量(0.23mg/g)

6、是對(duì)照組的2.1倍，虎杖苷含量則變化不顯著。
　　 3.2 紫外線輻射對(duì)白藜蘆醇及虎杖苷積累的影響
　　 持續(xù)的紫外線輻射可提高虎杖組培物中白藜蘆醇含量，除輻射處理7h、9h組虎杖苷含量與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異外，其余處理組中虎杖苷含量均有提高，其中紫外線輻射3h時(shí)，白藜蘆醇及虎杖苷均達(dá)到最高積累量，分別是對(duì)照組的2.3倍和1.9倍。
　　 3.3 添加水楊酸對(duì)白藜蘆醇及虎杖苷積累的影響
　　 水楊酸是啟

7、動(dòng)植物防御應(yīng)答的誘導(dǎo)子，將不同濃度的水楊酸溶液添加到虎杖組培苗培養(yǎng)基中，考察該誘導(dǎo)子對(duì)白藜蘆醇及虎杖苷合成的影響。研究結(jié)果表明：除20mg/L水楊酸處理48 h白藜蘆醇含量略有降低外，其余處理組白藜蘆醇含量均有提高，是對(duì)照組的2.2～5.3倍，而虎杖苷含量均降低，僅為對(duì)照組的25.8～63.9[％]。所有處理中，以5mg/L水楊酸處理48h作用效果最好，組培苗中白藜蘆醇最高積累量可達(dá)到0.478mg/g。
　　 3.4 添加己烯

8、雌酚對(duì)白藜蘆醇及虎杖苷積累的影響
　　 將不同濃度的己烯雌酚溶液添加到組培苗生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，考察己烯雌酚對(duì)組培苗不同部位合成白藜蘆醇和虎杖苷能力的影響。結(jié)果顯示：添加己烯雌酚處理，對(duì)組培苗葉片及莖段中虎杖苷含量影響較大，可以在一定程度上提高葉片中虎杖苷的含量，白藜蘆醇含量變化則不明顯。固體培養(yǎng)基中添加100mg/L己烯雌酚有利于根部積累較多的白藜蘆醇，其含量為0.39 mg/g，是對(duì)照組的1.9倍。
　　 3.5 添加真菌

9、誘導(dǎo)子對(duì)白藜蘆醇及虎杖苷積累的影響
　　 培養(yǎng)基中添加30mg GE·L-1葡萄灰霉病菌的菌體誘導(dǎo)子，可提高組培苗根部白藜蘆醇的含量水平，最高含量為0.39mg/g，是對(duì)照組的2倍。而添加200mg GE·L-1該菌液濃縮物誘導(dǎo)子，可促使組培苗莖段積累較多的白藜蘆醇(0.25mg/g)，含量為對(duì)照組的1.6倍。
　　 第二部分
　　 歐亞旋覆花(Inula britannica L.var.Chinensis)為

10、菊科旋覆花屬傳統(tǒng)藥用植物，主要分布于歐洲、非洲和亞洲。最新藥理學(xué)研究表明，歐亞旋覆花中所含有的1-O-乙酰大花旋覆花內(nèi)酯(1-O-Acetylbritannilactone ABL)具有鎮(zhèn)痛消炎和抗癌活性。為了滿足科研及臨床的需要，人們從野生歐亞旋覆花中提取ABL，但是，該活性成分在原植物中的含量較低，并明顯受到許多外部因素的影響，且持續(xù)地從野生植物中提取活性成分，勢(shì)必會(huì)導(dǎo)致資源匱乏。因此，采用植物組織培養(yǎng)的方法，從組織培養(yǎng)物中獲取AB

11、L將是一條有效途徑。本文主要對(duì)歐亞旋覆花組培苗、黃化苗、自然根及愈傷組織的組織培養(yǎng)進(jìn)行了研究，利用生物反應(yīng)器對(duì)懸浮細(xì)胞進(jìn)行初步放大培養(yǎng)，并測(cè)定了不同組培物中ABL的含量水平。首次對(duì)歐亞旋覆花細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，初步探討了細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)與活性成分積累之間的關(guān)系。取得的主要結(jié)果如下：
　　 1 歐亞旋覆花的組織培養(yǎng)及活性成分含量測(cè)定研究
　　 通過(guò)植物組織培養(yǎng)的方法，獲得了歐亞旋覆花組培苗、黃化苗及自然根，并測(cè)定了其中ABL

12、的含量，以光照條件下培養(yǎng)的組培苗葉片中ABL含量較高(0.15mg/g)，分別是黃化苗葉片和自然根的1.9倍和2.5倍，因此，將其作為后期誘導(dǎo)愈傷組織的外植體材料，自然根和黃化苗的培養(yǎng)將有利于組培材料的擴(kuò)繁和實(shí)驗(yàn)材料的積累。
　　 2 愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)及利用生物反應(yīng)器進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)
　　 通過(guò)葉片外植體誘導(dǎo)出愈傷組織，并對(duì)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、含氮量進(jìn)行篩選，確定適宜愈傷組織繼代的培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L NAA+

13、0.5mg/L TDZ。當(dāng)培養(yǎng)基中NH4NO3和KNO3均為2.0g/L時(shí)有利于愈傷組織的生長(zhǎng)。經(jīng)過(guò)搖瓶培養(yǎng)和反復(fù)繼代篩選，建立了細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系，并利用生物反應(yīng)器進(jìn)行了7L的初步放大培養(yǎng)。
　　 3 初步探討了歐亞旋覆花細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)與活性成分積累之間的關(guān)系
　　 對(duì)歐亞旋覆花愈傷組織細(xì)胞、懸浮細(xì)胞進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察，研究表明，在ABL含量較高(0.19mg/g)的愈傷組織細(xì)胞中，細(xì)胞質(zhì)濃，細(xì)胞器豐富；而ABL含量較低(0