PrP單抗的研制及其在BSE的免疫組化檢測和癢病的株系特征研究中的應(yīng)用.pdf

1、BSE俗稱瘋牛病，1986年在英國首次發(fā)現(xiàn)，病原體是一種缺少核酸的蛋白顆粒，稱為朊毒體(Prion)，是神經(jīng)等細(xì)胞表面一種正常蛋白prpC的異構(gòu)體prpSc，近年來越來越多的證據(jù)支持BSE是人類nvCJD的病因，引起了全世界公眾對(duì)瘋牛病的恐慌。一個(gè)國家或地區(qū)的BSE風(fēng)險(xiǎn)狀況、發(fā)病情況和監(jiān)測系統(tǒng)的全面程度，已成為牛和牛產(chǎn)品進(jìn)出口貿(mào)易中一項(xiàng)重要指標(biāo)，其中監(jiān)測系統(tǒng)的有效性，關(guān)鍵取決于檢測手段的可靠性，而免疫組化診斷方法是BSE診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。<

2、br>　　在本研究中，首先克隆、表達(dá)、純化了羊、牛、人的PRNP基因，以純化的重組PrP蛋白免疫prp0/0小鼠，成功研制出系列PrP單抗，并對(duì)單抗的免疫學(xué)反應(yīng)特性進(jìn)行了詳細(xì)的研究。隨后，以自主研制的PrP單抗為核心試劑，成功建立了BSE免疫組化診斷方法，頒布為國家標(biāo)準(zhǔn)《牛海綿狀腦病診斷技術(shù)》(GB/T19180-2003)，開發(fā)的試劑盒獲得了國家新獸藥證書。該方法已用于我國BSE的實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測工作，至2006年底，共檢測了全國各地140

3、14份牛腦樣品，結(jié)果全部為陰性，與國際標(biāo)準(zhǔn)單抗6H4的檢測符合率為100％，為我國的“無瘋牛病國際認(rèn)證工作”積累了重要的試驗(yàn)數(shù)據(jù)[1，2]。最后，以PrP單抗為分子探針，在國際上最為詳盡地揭示了癢病小鼠適應(yīng)毒株RML的株系特征，包括prpSc的糖基化模式、腦部的病理學(xué)特征、prpSc的沉積特點(diǎn)等。
　　1羊、牛及人PrP基因的克隆及表達(dá)
　　根據(jù)Gene Bank中PrP基因序列設(shè)計(jì)引物，以羊、牛及人血液中提取的基因組DNA

4、為模板，PCR擴(kuò)增出PrP基因并進(jìn)行序列測定。同源性分析表明:推導(dǎo)的氨基酸序列，羊與牛的同源性為96.2％，羊與人的同源性為93.8％，牛與人的同源性為94.3％，羊、牛及人PrP的8肽重復(fù)區(qū)均為5個(gè)。將牛的PrP25～233aa基因、羊PrP77～226aa基因、羊PrP91～226aa基因、人PrP91～230aa基因克隆至原核表達(dá)載體pET32a，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，His·Bind(@) Kits純化表

5、達(dá)產(chǎn)物。SDS-PAGE電泳顯示:表達(dá)產(chǎn)物的分子量大小與預(yù)計(jì)相符;免疫印跡試驗(yàn)證實(shí):牛PrP25～233aa基因、羊PrP77～226aa基因、羊PrP94～226aa基因、人PrP94～230aa基因獲得了正確表達(dá)，具有良好的抗原性。
　　2 PrP單抗的研制及其免疫學(xué)反應(yīng)特性的研究
　　隨著BSE全球蔓延趨勢的加劇，我國迫切需要建立BSE免疫學(xué)檢測方法，具有相關(guān)免疫學(xué)反應(yīng)特性的PrP單抗是檢測的核心試劑。筆者以純化的重組

6、PrP蛋白免疫prp0/0小鼠，利用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，間接ELISA試驗(yàn)篩選出9株可持續(xù)分泌特異性PrP抗體的雜交瘤細(xì)胞4C11、7C11、4H10、13A4、9D11、11G8、8C10、13B11、1H2。隨后，對(duì)上述PrP單抗的抗原表位及免疫學(xué)反應(yīng)特性進(jìn)行了系統(tǒng)的鑒定。
　　以原核表達(dá)的牛/羊/人PrP、正常牛/羊的腦勻漿、BSE/羊癢病陽性的腦勻漿、BSE/羊癢病陽性的腦組織切片、癢病小鼠適應(yīng)毒株RML及22L的腦勻漿為

7、抗原，測定了9株單抗的ELISA、免疫印跡、免疫組化反應(yīng)特性。結(jié)果顯示:單抗4C11、1H2、8C10、13A4、13B11可用于BSE/羊癢病的ELISA、免疫印跡檢測;單抗4C11、8C10、13B11可用于BSE/羊癢病的免疫組化檢測。單抗1H2、13A4在免疫印跡及免疫組化試驗(yàn)中可識(shí)別癢病小鼠適應(yīng)毒株RML及22L。單抗7C11在免疫印跡試驗(yàn)中只與羊癢病PrP27-30反應(yīng)，結(jié)合其抗原表位77～93aa，證實(shí)了BSE與Scrap

8、ie的PrPSc PK消化位點(diǎn)存在差異;單抗4H10的抗原表位推測是羊癢病PrP27-30特異性的。
　　3單抗介導(dǎo)BSE免疫組化檢測方法的建立及其應(yīng)用
　　在免疫組化試驗(yàn)中，PrP單抗4C11可特異性識(shí)別BSE、羊癢病標(biāo)準(zhǔn)陽性腦組織樣品上prpSc核心片段，并與國際標(biāo)準(zhǔn)PrP單抗6H4具有相同的染色模式。用作核心試劑，建立了單抗介導(dǎo)BSE免疫組化診斷方法并標(biāo)準(zhǔn)化，現(xiàn)已頒布成為中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《牛海綿狀腦病診斷技術(shù)》(

9、GB/T19180-2003)，研發(fā)的BSE免疫組化診斷試劑獲得國家新獸藥證書。該方法應(yīng)用于中國BSE的實(shí)驗(yàn)室持續(xù)監(jiān)測工作，至2006年底，共檢測了全國各地采集的14，014份牛腦樣品，結(jié)果全為陰性，每批次所設(shè)立的陽性對(duì)照樣品檢測結(jié)果均呈陽性，與6H4檢測結(jié)果的符合率為100％，為我國“無瘋牛病國際認(rèn)證工作”積累了重要的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　4癢病小鼠適應(yīng)毒株RML的株系特征研究
　　癢病小鼠適應(yīng)毒株RML感染的N2a細(xì)胞(Sc-

10、N2a)，經(jīng)連續(xù)傳代后仍能穩(wěn)定增殖prpres，建立了感染癢病的細(xì)胞模型。以Sc-N2a細(xì)胞裂解物為接種體，腦內(nèi)接種C57BL/6J小鼠，經(jīng)200±28天的潛伏期后，接種的C57BL/6J小鼠全部發(fā)病死亡，臨床癥狀均表現(xiàn)為特征性的“共濟(jì)失調(diào)”，而對(duì)照組，接種N2a細(xì)胞裂解物的C57BL/6J小鼠以及接種Sc-N2a細(xì)胞裂解物的PrP基因敲除小鼠均正常存活，獲得了癢病感染的小鼠模型。隨后，PrP單抗作為分子探針，對(duì)癢病小鼠適應(yīng)毒株RML的

11、株系特征進(jìn)行了詳盡的研究。Sc-N2a細(xì)胞增殖的prpSc與發(fā)病小鼠腦組織中prpsc的免疫印跡圖譜展示了相同的糖基化模式，三種糖基化形式的prpSc具相同遷移率（分子量大小一致），而且均是以單糖基化形式為主。發(fā)病小鼠的病理學(xué)研究結(jié)果顯示:腦部的海綿狀空泡主要分布于腦干、大腦、小腦、丘腦;腦、脾臟、回腸末端檢測到prpSc，腦部的prpSc主要分布于大腦皮質(zhì)、海馬、丘腦，四迭體、小腦、嗅球有少量的分布。
　　綜上:
　　1、

12、成功克隆了羊、牛、人的PrP基因。同源性分析表明:推導(dǎo)的氨基酸序列，羊與牛的同源性為96.2％，羊與人的同源性為93.8％，牛與人的同源性為94.3％，羊、牛及人PrP的8肽重復(fù)區(qū)均為5個(gè)。
　　2、獲得了純化的重組牛PrP25～233aa、羊PrP77～226aa、羊PrP94～226aa、人PrP94～230aa，具有良好的抗原性。
　　3、研制出9株P(guān)rP單抗，并明確了其抗原表位及免疫學(xué)反應(yīng)特性，為下一步BSE及羊癢病

13、的免疫學(xué)診斷方法的研制打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。拿到針對(duì)PrP77～93aa抗原表位的單抗7C11，該表位處于BSE與羊癢病prpSc的PK消化位點(diǎn)的差異部位;單抗4H10的抗原表位推測是羊癢病PrP27-30特異性的;國內(nèi)外尚未見有同類單抗的報(bào)道。
　　4、建立了單抗介導(dǎo)BSE免疫組化診斷方法（BSE診斷的金標(biāo)準(zhǔn)），實(shí)現(xiàn)了我國BSE檢測技術(shù)的跨越性發(fā)展，現(xiàn)已頒布成為國家標(biāo)準(zhǔn)《牛海綿狀腦病診斷技術(shù)》(GB/T19180-2003)，用于我