普魯士藍(lán)修飾的馬脾鐵蛋白的類酶活性及其在免疫組化檢測中的應(yīng)用.pdf

1、生物酶在臨床診斷、生物分析等領(lǐng)域都有重要的應(yīng)用，雖然已經(jīng)被廣泛商品化，但是存在成本高、保存困難等缺點(diǎn)。納米結(jié)構(gòu)的模擬酶由于易于制備、成本低、穩(wěn)定并且催化活性高，已經(jīng)成為納米研究領(lǐng)域中的一個熱點(diǎn)。近年來，普魯士藍(lán)納米顆粒(Prussianbluenanoparticles，PBNPs)在模擬酶領(lǐng)域受到了廣泛的關(guān)注，由于具備較低的氧化還原電位和良好的電子傳遞能力，PBNPs被認(rèn)為是一種高性能的人工模擬酶，從而在電化學(xué)生物傳感器的組建中得到了

2、廣泛的應(yīng)用。
　　 鐵蛋白(ferritin)是一種由24個單位結(jié)構(gòu)相似的亞基自組裝形成的納米尺度的蛋白質(zhì)，由外部的蛋白質(zhì)殼層和內(nèi)部的以水合氧化鐵為主要成分的鐵核組成。它是一種天然的納米結(jié)構(gòu)，具有特殊的生物功能。各種天然的鐵蛋白(含鐵)和重組鐵蛋白(無鐵)已經(jīng)被使用作為模板來合成各種納米顆粒，如磁性Fe3O4納米顆粒、半導(dǎo)體CdS量子點(diǎn)、Au原子團(tuán)簇、Pt納米顆粒，等等。雖然人類、馬、牛蛙和細(xì)菌等的鐵蛋白在一級結(jié)構(gòu)上有很大的差異

3、，但是本質(zhì)上它們擁有相同的體系結(jié)構(gòu)，所以其他機(jī)體的鐵蛋白應(yīng)該和人類的鐵蛋白具有相同的功能。研究發(fā)現(xiàn)，很多腫瘤細(xì)胞表面大量表達(dá)鐵蛋白特異性受體，從而通過鐵蛋白受體-鐵蛋白的結(jié)合介導(dǎo)對鐵蛋白的內(nèi)吞作用。有報道指出，重鏈鐵蛋白(HFt)的受體是轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(Transferrinreceptor-1，TfR-1)，在腫瘤組織中，TfR-1的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于健康組織及癌周組織，這就使得鐵蛋白在腫瘤的診斷和治療中有很大的應(yīng)用潛力。
　　

4、本文中，我們設(shè)計(jì)了一種新的基于天然鐵蛋白模板的合成方法，無需去除內(nèi)部氧化鐵核。實(shí)驗(yàn)利用酸性條件下亞鐵氰化鉀在氧化鐵核表面的沉積反應(yīng)，從而得到了小尺寸的普魯士藍(lán)納米顆粒同時保留了蛋白質(zhì)殼的生物學(xué)特性。我們將這種復(fù)合結(jié)構(gòu)命名為普魯士藍(lán)修飾的鐵蛋白納米顆粒(Prussianbluemodifiedferritinnanoparticles，PB-FtNPs)。
　　 (1)通過溫度、pH以及反應(yīng)物比例的調(diào)控，實(shí)現(xiàn)了對PB-FtNPs的

5、尺寸和形貌的控制，并確定了溫度4℃、pH3.0、亞鐵氰化解/鐵蛋白摩爾比0.75∶1為最佳合成條件。用紫外可見光吸收譜、TEM、DLS等進(jìn)行表征，從而表明了普魯士藍(lán)的存在和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linkedadsorptionassay，ELISA)證明了在PB-FtNPs中，蛋白質(zhì)仍然具有特異性。對PB-FtNPs和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)修飾過的普魯士藍(lán)納米粒子的穩(wěn)定性研究表明，PB-FtNPs更加穩(wěn)定，

6、這可能是由于蛋白質(zhì)殼對普魯士藍(lán)的包覆作用。
　　 (2)選取了分別帶有正電荷和負(fù)電荷的色原底物3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)，以PB-FtNPs代替酶催化H2O2氧化色原底物從而引起顏色變化，驗(yàn)證了其具有過氧化物酶活性。米氏動力學(xué)分析結(jié)果表明，PB-FtNPs比尺寸相近的Fe3O4納米粒子具有更強(qiáng)的催化能力(高1～2個數(shù)量級)。類酶活性對pH、溫度和

7、PB-FtNPs濃度有很強(qiáng)的依賴性，對其過氧化物酶活性的pH依賴性檢測中，發(fā)現(xiàn)在中性或堿性條件下該催化活性幾乎喪失。通過溶解氧電極，我們發(fā)現(xiàn)在pH達(dá)到中性和堿性，PB-FtNPs具有類過氧化氫酶活性，可以催化H2O2分解產(chǎn)生氧氣。
　　 (3)免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PB-FtNPs對于胃癌、食管癌和乳腺癌具有特異性檢測的能力，分別達(dá)到29/30(96.7％)、29/31(93.5％)和71/92(77.2％)的靈敏度，研究了鐵蛋