脫氧核酶阻斷MecR1和BlaR1信號通路逆轉(zhuǎn)MRSA耐藥性的研究.pdf

1、本研究以mecR1/blaR1mRNA為靶基因，采用硫代脫氧核酶阻斷金黃色葡萄球菌MRSA的耐藥信號通路，從而逆轉(zhuǎn)MRSA的耐藥性，恢復(fù)苯唑西林對MRSA的抗菌活性。 研究方法： 1.選擇性抗mecR1mRNA的PS-DRz147逆轉(zhuǎn)MRSA耐藥性研究：利用電穿孔的方法將PS-DRz147導(dǎo)入細(xì)菌體內(nèi)，通過平板克隆形成實驗計數(shù)菌落數(shù)(CFU)；測定PS-DRz147對MRSA的最小抑菌濃度(MIC)的影響；通過RT-PC

2、R法檢測PS-DRz147對目的基因mecR1及其下游基因mecA表達(dá)的抑制作用。擴增產(chǎn)物在含溴化乙啶的1％的瓊脂糖凝膠中電泳，以16SrRNA為內(nèi)參照半定量mecR1及mecA的表達(dá)變化。實驗中PS-DRz147設(shè)5μg/ml、10μg/ml和15μg/ml三個劑量組，同時設(shè)空白對照組和隨機鏈對照組PS-DRz208(15μg/ml)。 2.選擇性抗blaR1mRNA的PS-DRz602逆轉(zhuǎn)MRSA耐藥性研究：以blaR1mR

3、NA為靶基因設(shè)計硫代脫氧核酶PS-DRz602。利用電穿孔的方法將PS-DRz602導(dǎo)入細(xì)菌體內(nèi)，通過平板克隆形成實驗計數(shù)CFU；通過實時熒光定量RT-PCR法檢測PS-DRz602對基因blaR1及其下游基因blaZ表達(dá)的抑制作用。在含染料SYBRGreenI的密閉管中通過熒光強度變化定量起始模板量，以16SrRNA為內(nèi)參照相對定量blaR1及blaZ的表達(dá)變化。實驗中PS-DRz602設(shè)5μg/ml、10μg/ml和15μg/ml三

4、個劑量組，同時設(shè)空白對照組和隨機鏈對照組PS-DRz341(15μg/ml)。 3.選擇性抗mecR1mRNA的PS-DRz147和抗blaR1mRNA的PS-DRz602共同逆轉(zhuǎn)MRSA耐藥性研究：利用電穿孔的方法將PS-DRz147、PS-DRz602導(dǎo)入細(xì)菌體內(nèi)，通過平板克隆形成實驗計數(shù)CFU；通過實時熒光定量RT-PCR法檢測PS-DRz147、PS-DRz602對基因mecR1、blaR1及其下游基因mecA、blaZ

5、表達(dá)的抑制作用。在含染料SYBRGreenI的密閉管中通過熒光強度變化定量起始模板量，以16SrRNA為內(nèi)參照相對定量mecR1、mecA及blaR1、blaZ的表達(dá)變化。實驗中設(shè)10μg/mlDRz147；10μg/mlDRz147+10μg/mlDRz341；10μg/mlDRz602；10μg/mlDRz602+10μg/mlDRz208；5μg/mlDRz147+5μg/mlDRz602五個組合劑量組，同時設(shè)空白對照組和隨機鏈對

6、照組10μg/mlDRz208+10μg/mlDRz341。 研究結(jié)果： 1.選擇性抗mecR1mRNA的PS-DRz147逆轉(zhuǎn)MRSA耐藥性：實驗組(PS-DRz147)M-H瓊脂培養(yǎng)基上WHO-2的菌落數(shù)明顯低于空白對照組(P＜0.01)，并隨著PS-DRz147濃度的增加，抑制WHO-2菌落生長的作用增強；PS-DRz147各組的MIC值(8μg/ml)較空白對照組(32μg/ml)有所下降；RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)

7、果顯示PS-DRz147能明顯抑制mecR1及其下游基因mecAmRNA的表達(dá)，并具有劑量依賴性抑制效應(yīng)(P＜0.05)。而隨機對照鏈PS-DRz208對WHO-2菌落的生長、MIC值及mecR1和mecAmRNA的表達(dá)均沒有明顯的影響(P＞0.05)。 2.選擇性抗blaR1mRNA的PS-DRz602逆轉(zhuǎn)MRSA耐藥性：與空白對照組相比，實驗組(PS-DRz602)能顯著抑制M-H瓊脂培養(yǎng)基上WHO-2的生長(P＜0.01)

8、，并隨著PS-DRz602濃度的增加，抑制WHO-2菌落生長的作用增強；real-timeRT-PCR結(jié)果顯示PS-DRz147能明顯抑制blaR1及其下游基因blaZmRNA的表達(dá)，并具有劑量依賴性抑制效應(yīng)。而隨機對照鏈PS-DRz341對WHO-2菌落的生長及blaR1和blaZ的mRNA的表達(dá)均沒有明顯的影響(P＞0.05)。 3.選擇性抗mecR1mRNA的PS-DRz147和抗blaR1mRNA的PS-DRz602共同

9、逆轉(zhuǎn)MRSA耐藥性研究：合用DRz147和DRz602，阻斷MRSA的雙耐藥基因表達(dá)信號通路能顯著抑制M-H瓊脂培養(yǎng)基上WHO-2的生長(P＜0.01)；real-timeRT-PCR結(jié)果顯示PS-DRz147能明顯抑制耐藥基因(mecR1-mecA和blaR1-blaZ)的表達(dá)。與阻斷單條耐藥基因表達(dá)信號通路相比，對MRSA的抑制作用更加明顯(P＜0.05)。而隨機對照鏈PS-DRz208或PS-DRz341對WHO-2菌落的生長及耐

10、藥基因的表達(dá)均沒有明顯的影響(P＞0.05)。 研究結(jié)論： 1.抗mecR1mRNA的PS-DRz147選擇性抑制了WHO-2的mecR1和mecA的表達(dá)，有效的降低了MRSA對苯唑西林的耐藥性。 2.抗blaR1mRNA的PS-DRz602選擇性抑制了WHO-2的blaR1和blaZ的表達(dá)，有效的降低了MRSA對苯唑西林的耐藥性。 3.合用抗mecR1mRNA的PS-DRz147和抗blaR1mRNA的