HELA荷瘤鼠MDSC與HMGB1的檢測及恩度體外抗瘤作用研究.pdf

1、目的:
　　本研究通過檢測小鼠宮頸癌移植瘤模型中HMGB1和髓源性抑制細(xì)胞(MDSC)的表達(dá)水平，分析兩者在腫瘤微環(huán)境中的相關(guān)性及作用;同時，探討缺氧情況下，重組人血管內(nèi)皮抑制素(恩度)體外誘導(dǎo)Hela宮頸癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制，為宮頸癌免疫干預(yù)治療提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.人宮頸癌Hela細(xì)胞系建立裸鼠皮下種植瘤模型，成瘤后取荷瘤小鼠的脾臟、腫瘤組織及外周血制成單細(xì)胞懸液，通過流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測脾臟、外周血

2、中MDSC細(xì)胞的百分比例。
　　2.分別采用Western blotting、RT-qPCR方法檢測癌和癌旁組織中HMGBl蛋白和mRNA的表達(dá)水平。
　　3.通過Percoll密度梯度離心法和免疫磁珠分選法，分離、純化荷瘤鼠脾臟來源的MDSC細(xì)胞，RT-qPCR檢測純化后的MDSCs自身Arg-1和iNOS的mRNA表達(dá)水平。
　　4.體外培養(yǎng)人宮頸癌HeLa細(xì)胞，在低氧的環(huán)境下分別給予以下處理24小時:PBS、恩度

3、、恩度聯(lián)合3-甲基腺嘌呤(3-MA)，通過Hoechst33258染色及Annexin V-FITC/PI雙染結(jié)合FCM檢測Hela細(xì)胞的凋亡水平，Western blotting檢測微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC-3)、抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.與正常對照組相比，荷瘤鼠外周血和脾臟中CD11b+Gr-1+MDSC的比例明顯增高(p＜0.05)。與癌旁組織對照組相比，荷瘤鼠腫瘤組織中HMG

4、B1呈明顯高表達(dá)，具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。荷瘤鼠脾臟中CD11 b+Gr-1+MDSC％增高與腫瘤組織中HMGB1的高表達(dá)呈正下相關(guān)。
　　2.免疫磁珠分選法純化MDSCs的純度明顯優(yōu)于Percoll密度梯度離心法，純度可達(dá)89％左右。與正常鼠相比，從荷瘤鼠組分離出的MDSCs自身明顯高表達(dá)Arg-1和iNOS，具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。
　　3.Hoechst33258染色提示恩度在低氧環(huán)境下可以誘導(dǎo)Hela

5、細(xì)胞出現(xiàn)核碎裂，說明誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡;同樣的，Annexin V-FITC/PI染色結(jié)合FCM檢測發(fā)現(xiàn)恩度處理組誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率明顯高于另兩組;Western blotting跟其結(jié)果相一致，與另兩組相比，恩度處理HeLa細(xì)胞后，LC-3及Bax蛋白表達(dá)水平明顯升高且Bcl-2蛋白表達(dá)降低。
　　結(jié)論:
　　宮頸癌腫瘤微環(huán)境中，HMGB1的高表達(dá)與MDSCs的累積數(shù)量呈正相關(guān)，且與正常鼠相比，荷瘤鼠中MDSCs過表達(dá)免疫抑制介