補(bǔ)腎助孕方對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞ER、MMP-9、TIMP-1及卵巢黃體細(xì)胞分泌激素的影響.pdf

1、研究目的:觀察補(bǔ)腎助孕方對(duì)米非司酮干預(yù)的大鼠黃體期子宮內(nèi)膜細(xì)胞雌激素受體(ER)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)的調(diào)控及對(duì)大鼠黃體顆粒細(xì)胞分泌雌二醇(E2)、孕激素(P)水平的影響。探討補(bǔ)腎助孕方治療黃體功能不全性不孕的有效機(jī)理。
　　研究方法::1、含藥血清制備:選用普通雄兔5只，予補(bǔ)腎助孕方藥煎液40g/kg灌胃（相當(dāng)于成人臨床劑量的10倍），2次/d，連續(xù)3d。第四天末次灌胃1h

2、(灌胃前禁食不禁水12h)，局部麻醉頸動(dòng)脈采血，室溫靜置3h，3000rpm離心分離血清15min，收集血清，-20℃保存，56℃水浴滅活補(bǔ)體30min，0.22um微孔濾膜過濾除菌，使用前無血清DMEM稀釋至5％、20％濃度的含藥血清。2、子宮內(nèi)膜細(xì)胞、卵巢黃體細(xì)胞的分離、培養(yǎng):選擇體重50-60g未成年雌性大鼠5只，皮下注射PMSG50U/只，60h卵泡發(fā)育成熟，在皮下注射HCG35U/只，注射后第七天(HCG注射日為第1天)，拉頸

3、斷髓法處死，摘取卵巢、子宮，分離和培養(yǎng)子宮內(nèi)膜細(xì)胞和卵巢黃體細(xì)胞。表型鑒定后將子宮內(nèi)膜細(xì)胞、卵巢黃體細(xì)胞培養(yǎng)于含有100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素、10％空白血清、DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每日觀察生長(zhǎng)情況，貼壁3-5d傳代一次。傳代用0.25％胰酶+DMEM培養(yǎng)液。3、含藥血清干預(yù):加用藥干預(yù)48h后，提取各組細(xì)胞蛋白、RNA及細(xì)胞上清液，觀察補(bǔ)腎助孕方含藥血清對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞ERα、ERβ、MMP

4、-9、TIMP-1及卵巢顆粒細(xì)胞分泌雌、孕激素水平的影響。Western blot方法檢測(cè)子宮內(nèi)膜細(xì)胞ERα、ERβ蛋白表達(dá)，RT-PCR法檢測(cè)子宮內(nèi)膜細(xì)胞ERα、ERβ、MMP-9、TIMP-1mRNA的表達(dá)量，放射免疫法檢測(cè)黃體顆粒細(xì)胞上清液雌、孕激素的水平。
　　研究結(jié)果:(1)補(bǔ)腎助孕方含藥血清對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞ERα、ERβ蛋白的表達(dá)有提高作用;同時(shí)明顯改善米非司酮所致的ERα、ERβ蛋白的低表達(dá);(2)補(bǔ)腎助孕方含藥血清對(duì)

5、子宮內(nèi)膜細(xì)胞ERα、ERβ、MMP-9、TIMP-1mRNA的表達(dá)有提高作用;同時(shí)明顯改善米非司酮所致的ER、MMP-9、TIMP-1的低表達(dá);(3)補(bǔ)腎助孕方含藥血清明顯提高卵巢黃體細(xì)胞分泌雌、孕激素水平。
　　研究結(jié)論:(1)補(bǔ)腎助孕方通過提高子宮內(nèi)膜細(xì)胞ER、MMP-9、TIMP-1的表達(dá)，改善子宮內(nèi)膜的容受性，有利于胚胎著床妊娠，為孕卵著床奠定基礎(chǔ);(2)補(bǔ)腎助孕方藥能顯著提高卵巢黃體細(xì)胞分泌E2、P水平，改善米非司酮所致