致急性纖維肉瘤的缺陷型J亞群禽白血病病毒腫瘤基因的鑒定.pdf

1、根據(jù)致瘤機(jī)制的不同，禽白血病/肉瘤病毒群各成員病毒被劃分慢性轉(zhuǎn)化型病毒和急性轉(zhuǎn)化型病毒兩類。慢性轉(zhuǎn)化型病毒通過(guò)插入啟動(dòng)機(jī)制間接激活細(xì)胞原癌基因(c-onc)而引發(fā)腫瘤，潛伏期較長(zhǎng)，一般超過(guò)90天；而急性轉(zhuǎn)化型病毒則是通過(guò)直接啟動(dòng)自身基因組中攜帶的病毒腫瘤基因(v-onc)而導(dǎo)致急性腫瘤的形成，潛伏期一般僅在數(shù)周之內(nèi)(FadlyandNair，2008)。
　　 禽ALV-J的原型毒株HPRS-103是一種復(fù)制完整型病毒，其基因組

2、中不含有任何病毒致瘤基因，在機(jī)體內(nèi)不能快速誘發(fā)腫瘤的形成，在體外也不能轉(zhuǎn)化雞骨髓細(xì)胞(Payneetal.，1992)。而在1993年，Payne等從該株病毒感染的表現(xiàn)有髓細(xì)胞瘤的實(shí)驗(yàn)室病雞中分離到了數(shù)株攜帶有腫瘤基因v-myc的急性轉(zhuǎn)化型病毒，這些病毒大多可以轉(zhuǎn)化體外的骨髓細(xì)胞，在雞體上可導(dǎo)致多種急性腫瘤的發(fā)生，如髓細(xì)胞瘤、腎胚細(xì)胞瘤及腎腺瘤等，而其中的966株則得到了較為詳盡的研究(Payneetal.，1993)。2000年，Ve

3、nugopal等從自然感染J亞群病毒的患有成紅細(xì)胞性白血病的雞群中分離到若干株含v-myc的急性病毒，它們不僅可以誘發(fā)急性成紅細(xì)胞增多病，而且還能導(dǎo)致髓細(xì)胞瘤和其他腫瘤的形成(Venugopaletal.，2000)。
　　 Fujinami肉瘤病毒(FSV)于1914年從日本分離出來(lái)(FujinamiandInamoto，1914)，起初曾認(rèn)為它和帶有v-src腫瘤基因的勞斯肉瘤病毒(RousSarcomaVirus，RSV)

4、是同一病毒的不同毒株，后來(lái)經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)它是完全不同的另一種帶有v-fps腫瘤基因的急性缺陷型病毒(ShibuyaandHanafusa，1982)。此外，PRCⅡ是一株從自然發(fā)病雞中分離的在5'-fps端缺失1020個(gè)核苷酸的此類型毒株，它轉(zhuǎn)化細(xì)胞能力及致腫瘤能力稍弱(Carlbergetal.，1984；Huangetal.，1984)。
　　 近年來(lái)，我們發(fā)現(xiàn)在國(guó)內(nèi)爆發(fā)該病的雞群中出現(xiàn)了急性肉瘤病例，病例組織切片法檢測(cè)表明

5、其為典型纖維肉瘤，通過(guò)病毒分離試驗(yàn)確定病料中含有ALV-J(劉紹瓊等，2011)。肉瘤組織研磨濾過(guò)液及其接種過(guò)的第一代DF細(xì)胞上清，在接種1日齡SPF雞和817肉雜雞后，可以在9天內(nèi)復(fù)制出相同的纖維肉瘤(李傳龍等，2012)。因此，我們懷疑其中除了含有完整復(fù)制型的ALV-J外，很可能還存在一種可以引發(fā)快速致瘤的攜有某種病毒腫瘤基因(v-onc)的缺陷型病毒。
　　 本研究課題初步探究了缺陷型病毒在體外CEF細(xì)胞培養(yǎng)中的生物學(xué)活性

6、；提取病料中的病毒RNA和前病毒DNA，使用PCR法篩選到相關(guān)v-onc；然后制備針對(duì)該基因所編碼蛋白的特異性抗血清，建立免疫熒光方法、免疫組化法分別對(duì)感染細(xì)胞中的病毒抗原、肉瘤組織切片進(jìn)行檢測(cè)；構(gòu)建含有該腫瘤基因的缺陷型病毒的全基因組質(zhì)粒，拯救分子克隆化病毒，回歸動(dòng)物復(fù)制病征，從而在分子和蛋白質(zhì)兩個(gè)水平上佐證缺陷型病毒是造成急性纖維肉瘤的主因。
　　 為了觀察肉瘤病料中缺陷型病毒在體外細(xì)胞培養(yǎng)中的增殖能力，分別將肉瘤組織濾過(guò)液

7、及其感染后的細(xì)胞第1代毒、第2代毒接種相同的三組試驗(yàn)雞只，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第1代細(xì)胞毒同肉瘤研磨液具有相似的致瘤能力，但第3代細(xì)胞毒的致瘤速度及誘發(fā)雞只出現(xiàn)腫瘤的比例則明顯下降，這表明肉瘤中存在的缺陷型病毒粒子在體外CEF細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，產(chǎn)生的子代病毒粒子會(huì)逐漸減少，結(jié)合其不能引起CEF出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)的現(xiàn)象，我們推測(cè)該類缺陷型病毒很可能不適應(yīng)在CEF上生長(zhǎng)。
　　 使用PCR方法，我們擴(kuò)增到了復(fù)制完整型ALV-J病毒粒子的完整基因組(

8、命名為SD1005)，同國(guó)內(nèi)外其他12個(gè)J亞群毒株比對(duì)發(fā)現(xiàn)，它與引發(fā)慢性髓細(xì)胞瘤和血管瘤的毒株JS09GY6(Wuetal.，2010)具有相似的基因組結(jié)構(gòu)，且整體核酸同源性高達(dá)97％，與其它毒株相比，亦沒(méi)有顯著的基因缺失或突變。而且，其基因組結(jié)構(gòu)中并不含有任何病毒腫瘤基因，與J亞群病毒原型株HPRS-103同屬于完整復(fù)制型病毒，再結(jié)合禽白血病/肉瘤病毒致瘤機(jī)制(FadlyandNair，2008)，可以排除SD1005是導(dǎo)致這種急性腫

9、瘤形成的原因。隨后，使用多對(duì)擴(kuò)增不同腫瘤基因嵌合體分子的引物，我們確定了數(shù)個(gè)含有v-fps腫瘤基因的缺陷型基因組(Fu-J1～5)，其結(jié)構(gòu)特征為：5'-R-U5-△gag-fps-△env-U3-R-3'或5'-R-U5-△gag-fps-△pol-△env-U3-R-3’。在env基因水平上，F(xiàn)u-Js同SD1005的同源性超過(guò)99％，這說(shuō)明缺陷型Fu-Js很可能起源于作為輔助病毒的SD1005。值得注意的是，盡管Fu-Js中的v-f

10、ps基因同F(xiàn)ujinami和PRCⅡ株的v-fps基因具有超過(guò)98％的核酸同源性，但不同的是，F(xiàn)SV和PRCⅡ二者在該基因的5’和3’完全一致，而我們所擴(kuò)增到的所有序列在5'端則相對(duì)缺少24堿基(但與gag基因的結(jié)合位點(diǎn)穩(wěn)定)，在3’則有200～500nt的缺失，長(zhǎng)度較多樣化，且插入位點(diǎn)也不穩(wěn)定。
　　 使用DNAstar軟件分析并篩選兩段抗原性較好的截短fps基因，連接到pET32a(+)載體中，經(jīng)E.coli表達(dá)系統(tǒng)獲得人工

11、Fps蛋白，免疫后得到鼠抗Fps多克隆血清，建立間接免疫熒光方法并檢測(cè)肉瘤組織懸液感染的CEF細(xì)胞，結(jié)果呈現(xiàn)陽(yáng)性，表明急性肉瘤中確實(shí)存在一種可以編碼Fps相關(guān)蛋白的缺陷病毒。同時(shí)，建立免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)纖維肉瘤組織切片，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中存在Fps腫瘤蛋白。
　　 選取Fu-J1和Fu-J3兩個(gè)基因組，通過(guò)重疊延伸PCR技術(shù)(SOE-PCR)和限制性內(nèi)切酶酶切技術(shù)分別獲得質(zhì)粒pTZ57一Fu-J1和pTZ57-Fu-J3。參考Fu

12、jinami基因組，合成一段fps序列，將缺少219nt的3'-fps段添補(bǔ)到質(zhì)粒pTZ57-Fu-J1中，構(gòu)建了另外兩個(gè)質(zhì)粒pTZ57-Fu-J1E和pTZ57-Fu-J1M。將這4種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到CEF細(xì)胞中，使用制備的抗Fps血清，可以檢測(cè)到陽(yáng)性細(xì)胞的存在，但是以其上清再次接種新的CEF，卻不能檢測(cè)到熒光的存在，這表明盡管質(zhì)粒的構(gòu)建是成功的，能夠產(chǎn)生瞬時(shí)表達(dá)，但卻不能拯救到有傳染性的分子克隆化病毒。正如同體外傳代試驗(yàn)所證明的那樣，該病

13、毒很可能不適合在體外CEF中培養(yǎng)。而使用質(zhì)粒DNA直接接種SPF雞的試驗(yàn)中，有1只雞在接種后19天后在接種部位出現(xiàn)了肉瘤腫塊，并證實(shí)是纖維肉瘤。
　　 我們推測(cè)，反轉(zhuǎn)錄病毒ALV-J在與雞體原癌基因的重組過(guò)程中可能會(huì)產(chǎn)生多個(gè)在基因水平上有差異個(gè)體，它們形成一個(gè)準(zhǔn)種群體(quasispecies)，而其中僅有一個(gè)或是數(shù)個(gè)具有生物學(xué)活性，而其他的則是無(wú)效基因體。我們的試驗(yàn)結(jié)果表明，含有v-fps的相關(guān)缺陷型J亞群白血病病毒是誘導(dǎo)急性