J亞群禽白血病病毒表面糖蛋白SU和兔IGFc融合蛋白的表達及初步應(yīng)用.pdf

1、禽白血病病毒(avian leukosis virus，ALV)是一種能引起禽類多種類型腫瘤的反轉(zhuǎn)錄病毒，包括A-J等10個亞群。其中J亞群禽白血病病毒(Subgroup J of avian leukosis virus，ALV-J)是20世紀80年代末Payne等首先從肉雞中分離鑒定出來的亞群。自1999年我國首次分離ALV-J以來，ALV-J已從肉用雞群向蛋用型雞群和地方品系雞群傳播。這種傳播可能是因為抗原變異使ALV-J感染特性

2、和宿主范圍發(fā)生了改變。囊膜蛋白(Envelopeprotein)是決定ALV-J宿主范圍的關(guān)鍵因素，其中表面糖蛋白gp85(SU)介導(dǎo)病毒與細胞受體的結(jié)合。ALV-J的SU蛋白基因序列存在不同程度變異，且變異程度較其他亞群高，這可能導(dǎo)致ALV-J的細胞嗜性和細胞受體種類發(fā)生變化，繼而影響到病毒的宿主范圍。因此，獲得一種能夠用于分離鑒定病毒受體的誘餌蛋白至關(guān)重要。本研究通過兩種真核表達系統(tǒng)表達ALV-J SU和兔IgGFc融合蛋白，為AL

3、V-J受體的研究提供工具。繼而以SUJ-IgGFc融合蛋白為工具，利用免疫共沉淀方法捕獲易感細胞受體蛋白，為研究細胞受體在病毒感染過程中的作用以及病毒感染的入侵機制奠定基礎(chǔ)。
　　1.ALV-J SU和免IgG Fc融合基因在桿狀病毒表達系統(tǒng)中的表達及其初步應(yīng)用
　　為了獲得ALV-J SU和兔IgG Fc的融合蛋白，用于研究ALV-J與宿主的相互作用，本研究用已構(gòu)建的pcDNA3.1-SUJ-IgGFc為模板，用PCR方法

4、擴增出SUJ-IgGFc基因，并克隆至pFastBac(1)質(zhì)粒，構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pFastBac(1)-SUJ-IgGFc;再將其轉(zhuǎn)化DH10BacTM感受態(tài)細胞，獲得重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒rBacmid-SUJ-IgGFc;最后在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染sf9細胞，獲得重組桿狀病毒rBac-SUJ-IgG Fc。免疫熒光試驗結(jié)果顯示，重組桿狀病毒表達的融合蛋白可被ALV-J單抗JE9以及羊抗兔IgG全分子所識別。Western blot結(jié)果顯示

5、，表達的融合蛋白的分子量大小約95 kDa。該融合蛋白的表達為細胞表面ALV-J受體的研究提供了有力工具。
　　用常規(guī)蛋白提取法提取ALV-J易感細胞DF1的總蛋白，以純化的SUJ-IgGFc融合蛋白為工具，應(yīng)用免疫沉淀的方法捕獲ALV-J受體蛋白，結(jié)果獲得兩種差異蛋白，經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定分別為中心體蛋白(Centrosomal protein)和Ⅱ型角蛋白細胞骨架1類似物(keratin，typeⅡ cytoskeletal1-li

6、ke)，二者與已報道的ALV-J受體chNHE1不相符。這一結(jié)果提示DF1細胞可能存在除NHE-1受體之外能與SU結(jié)合的蛋白。
　　2.ALV-J SU和兔IgGFc融合基因在腺病毒表達系統(tǒng)中的表達及其初步應(yīng)用
　　鑒于昆蟲細胞表達系統(tǒng)對表達蛋白修飾的特點，在使用桿狀病毒表達載體表達某些蛋白時無法保持天然狀態(tài)，可能會影響互作蛋白的識別。因此，為了獲得更接近天然特性的SU-IgGFc融合蛋白，本研究將SUJ-IgGFc融合基因

7、克隆到pShuttle-CMV中，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-SUJ-IgGFc;將PmeⅠ線性化處理的重組質(zhì)粒與pAdEasy-1共轉(zhuǎn)化BJ5183-AD-1細胞，經(jīng)同源重組及抗性篩選和酶切鑒定得到重組腺病毒質(zhì)粒pAd-SUJ-IgGFc。再將Pac1線性化的重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞，得到重組腺病毒rAd-SUJ-IgGFc。經(jīng)PCR鑒定證實重組腺病毒含SUJ-IgGFc基因。同時免疫熒光試驗結(jié)果顯示，重組腺病毒在

8、293T細胞得到表達，且表達的融合蛋白可被ALV-J單抗JE9以及羊抗兔IgG全分子所識別。Western blot結(jié)果表明，融合蛋白分子量大小約為95 kDa，且與JE9單抗以及羊抗兔IgG全分子都有很好的反應(yīng)性。以上結(jié)果證實，本研究成功構(gòu)建了重組腺病毒表達載體rAd-SUJ-IgGFc，并在293T、MDCK等真核細胞中大量表達，為進一步對商品蛋雞ALV-J受體或共受體的研究提供材料。
　　通過提取ALV-J易感細胞DF1的總