攜帶黑鯛AS-prohepc2及擬穴青蟹Scy1抗菌肽基因的減毒活菌載體系統(tǒng)作為口服免疫途徑的研究.pdf

1、抗菌肽是魚、蝦、貝等非特異性免疫防御系統(tǒng)的主要成分之一，在防御外源性病原體入侵方面起著重要作用。作為一類獨特的天然免疫活性物質(zhì)，抗菌肽具有廣譜的抗微生物活性和免疫調(diào)節(jié)活性。迄今從魚類、甲殼動物、貝類等海洋動物中已分離獲得了多種不同類型的抗菌肽，并揭示了其基因和蛋白結(jié)構(gòu)以及表達特性、抗微生物活性以及某些抗菌機理;現(xiàn)有試驗結(jié)果亦逐漸證明抗菌肽有望作為抗生素一定程度的替代品，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)及其他行業(yè)具有應(yīng)用前景，但迄今對其有效利用途徑且進入機體

2、后的免疫效應(yīng)知之甚少。
　　天然運載載體（如細菌、病毒和哺乳動物細胞等）具有良好的體內(nèi)功能和藥物運載載體特性，活菌載體是其中廣泛應(yīng)用的載體系統(tǒng)之一，可將目的蛋白基因插入活細菌的染色體或質(zhì)粒載體中，將目的蛋白基因運送到機體內(nèi)發(fā)揮作用。口服免疫途徑是未來抗菌肽產(chǎn)品有效應(yīng)用于魚類等養(yǎng)殖業(yè)的主要途徑，目前主要以基因工程產(chǎn)品形式作為飼料添加劑應(yīng)用，而活菌載體系統(tǒng)是否可作為抗菌肽的有效利用途徑之一值得深入研究。本論文在已獲得的黑鯛抗菌肽Hep

3、cidin和擬穴青蟹Scygonadin1(Scy1)基因及相關(guān)抗菌活性與部分功能的研究基礎(chǔ)上，利用減毒沙門氏菌作為活菌載體，將兩種抗菌肽基因克隆到減毒沙門氏菌，通過口服途徑，研究了運載抗菌肽的減毒沙門氏菌載體在魚體中應(yīng)用的可行性、安全性和有效性，該項探索性研究為抗菌肽未來在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用提供了一種新思路。主要研究成果如下:
　　1、建立黑鯛抗菌肽hepcidin前體（AS-prohepc2）的原核表達系統(tǒng):人工合成AS-he

4、pc2和AS-hepc6成熟肽，抗菌譜研究結(jié)果顯示兩種多肽均具有廣譜的抑殺菌活性。利用已獲得的黑鯛AS-hepc2基因進一步構(gòu)建大腸桿菌pET28a/AS-prohepc2原核表達體系，可穩(wěn)定表達可溶性AS-prohepc2前體蛋白，體外抗菌試驗結(jié)果顯示，AS-prohepc2能抑制革蘭氏陽性和陰性菌生長。
　　2、證明青蟹抗菌肽Scy1真核表達產(chǎn)物體內(nèi)、外均具有抗菌活性:利用畢赤酵母真核表達系統(tǒng)獲得Scy1蛋白產(chǎn)物，體外試驗發(fā)現(xiàn)

5、Scy1真核表達產(chǎn)物共孵黑鯛巨噬細胞可增強其對嗜水氣單胞菌吞噬功能。進一步利用模式生物斑馬魚觀察了其在體內(nèi)的抗菌功能，研究發(fā)現(xiàn)Scy1與嗜水氣單胞菌共注射或預(yù)注射斑馬魚，可在感染早期推遲死亡的爆發(fā)，對斑馬魚起到一定保護作用。
　　3、體內(nèi)外過表達試驗證明了利用轉(zhuǎn)運系統(tǒng)導(dǎo)入抗菌肽的可行性:將Scy1和AS-prohepc2的真核表達載體導(dǎo)入鯉魚EPC細胞進行過表達。前者細胞培養(yǎng)上清中共孵的金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、嗜水氣單胞菌和熒

6、光假單胞菌具有生長抑制作用。而后者則無明顯抗菌功能。利用肌肉電轉(zhuǎn)化方式，將Scy1真核表達載體導(dǎo)入模式生物斑馬魚體內(nèi)進行過表達。斑馬魚嗜水氣單胞菌感染實驗顯示肌肉過表達Scy1對斑馬魚起到一定程度的保護作用，說明Scy1基因通過轉(zhuǎn)運系統(tǒng)進入機體有效發(fā)揮免疫作用具有可行性。
　　4、減毒鼠傷寒沙門氏菌攜帶抗菌肽基因運載系統(tǒng)的建立及其初步應(yīng)用研究:以減毒鼠傷寒沙門氏菌作為活菌載體，構(gòu)建青蟹抗菌肽Scy1基因或蛋白運載系統(tǒng)，在海洋魚類黑

7、鯛體內(nèi)進行了體內(nèi)定植、表達、安全性及免疫功能等一系列研究。
　　(1)構(gòu)建Scy1原核及真核表達載體:原核載體pYA248可表達asd基因，與asd缺失的沙門氏菌減毒株X4072互補形成平衡致死系統(tǒng)。真核載體pCMV-HA-asd載體將pCMV-HA載體的卡那霉素抗性基因替換為asd基因，從而構(gòu)成平衡致死系統(tǒng)，使目的基因更加穩(wěn)定地在動物體內(nèi)表達。此外在pCMV-HA-asd載體的基礎(chǔ)上構(gòu)建分泌型載體pCMV-ScySP-HA-as

8、d，使Scy1基因在細胞中表達后可分泌到細胞胞外。本研究通過Western blot在體外水平驗證了這四種載體Scy1的蛋白表達。
　　(2)初步確定了沙門氏菌在黑鯛消化道的定植條件和時間:黑鯛經(jīng)灌胃處理減毒沙門氏菌后，通過腸道組織勻漿液涂布培養(yǎng)基實驗表明減毒沙門氏菌可在腸道中定植長達20天，而減毒志賀氏菌僅能定植10天左右;將減毒沙門氏菌直接灌胃黑鯛后在消化道可檢測到大量沙門氏菌，而將沙門氏菌懸液與飼料混合飼喂黑鯛的定植效果較差

9、;攜帶平衡致死宿主載體系統(tǒng)的沙門氏菌可定植20天，相反，自殺型載體沙門氏菌僅能在胃腸道定植5天左右。此外，減毒沙門氏菌在黑鯛腸道中逐漸減少并最終排出體外，顯示其作為基因治療載體的安全性。
　　(3)揭示減毒沙門氏菌在體內(nèi)的組織分布和蛋白表達情況:灌胃減毒沙門氏菌后，除了在胃腸道中分離培養(yǎng)到減毒沙門氏菌，肝臟、腎臟、脾臟也有較多沙門氏菌定植，心臟和鰓中有極少沙門氏菌，血液和肌肉中未檢測到沙門氏菌。灌胃沙門氏菌體系X4072（pYA2

10、48/Scy1）在胃、腸道、脾臟、腎臟、肝臟、鰓等器官中均檢測到Scy1的基因表達。其中Scy1在腸道和脾臟中表達持續(xù)時間較長。沙門氏菌與Scy1真核表達質(zhì)粒運載系統(tǒng)在體內(nèi)定植試驗發(fā)現(xiàn)，利用平衡致死系統(tǒng)沙門氏菌X4072(pCMV-HA-Scy1-asd)可在黑鯛腸道和脾臟的切片中檢測到Scy1，而自殺型沙門氏菌X4072(pCMVHA/Scy1)僅在腸道切片中檢測到Scy1。
　　(4)對灌胃減毒沙門氏菌后的黑鯛進行了安全性評價

11、:研究發(fā)現(xiàn)，灌胃減毒沙門氏菌7d后氧化應(yīng)激指標(biāo)(SOD、T-AOC、MDA、NO)、免疫相關(guān)指標(biāo)(LSM)、肝損傷指標(biāo)(GOT, GPT)與生理鹽水和空白對照組相比均沒有顯著改變，說明各濃度沙門氏菌對黑鯛的正常生理狀態(tài)無損傷作用。當(dāng)高濃度沙門氏菌運載Scy1基因在黑鯛體內(nèi)表達后，與空載體組相比，SOD活性和MDA量升高，活性氮自由基NO也有一定程度上升，說明Scy1在魚體內(nèi)表達后可能引起黑鯛活性自由基增加，導(dǎo)致抗氧化系統(tǒng)的激活。另外黑鯛

12、部分腸道組織結(jié)構(gòu)，在口服高濃度（109 cfu/尾）沙門氏菌后小腸絨毛增厚、空泡增加，可能引起腸道的輕微病理變化。因此，黑鯛給予口服量108 cfu/尾及以下濃度的減毒沙門氏菌X4072具有安全性。
　　(5)灌胃后對黑鯛免疫相關(guān)基因表達的影響:灌胃減毒沙門氏菌X4072（pYA248/Scy1）后，黑鯛IL-1β基因的表達有明顯提高(P=0.013)，CCL-4、IL-8、TNF-α、TLR9、LZM等基因表達也有誘導(dǎo)趨勢;而灌