唐氏綜合征患者誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的誘導(dǎo).pdf

1、目的：誘導(dǎo)出唐氏綜合征先天性心臟病患者(21三體型、易位型)及正常核型先天性心臟病患者的iPS細(xì)胞，觀察各型唐氏綜合征iPS細(xì)胞與正常核型iPS細(xì)胞及hES細(xì)胞之間的區(qū)別。建立唐氏綜合征的細(xì)胞模型（可用于藥物篩選、機(jī)制研究、再生醫(yī)學(xué)等）。
　　 方法：在3位先天性心臟病患者開胸手術(shù)過程中，取手術(shù)切口部位皮膚(約長5mm，寬2mm)進(jìn)行原代培養(yǎng)。該3位患者分別為擁有正常核型的室間隔缺損患者(VSD2n)、擁有易位型唐氏綜合征的房間

2、隔缺損患者(ASDTranslocation)、擁有21三體型唐氏綜合征的法洛四聯(lián)癥患者(TOFTrisomy21)。培養(yǎng)出皮膚成纖維細(xì)胞(HDF)后，采用Yamanaka經(jīng)典iPS誘導(dǎo)方法，利用慢病毒載體將OCT4、SOX2、KLF4、C-MYC導(dǎo)入該3位患者的皮膚成纖維細(xì)胞，經(jīng)過20～30d的培養(yǎng)，出現(xiàn)類似ES細(xì)胞的克隆。挑取該克隆進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞擴(kuò)增到一定數(shù)量后，利用AP染色、免疫細(xì)胞熒光染色、熒光定量PCR、半定量PCR、甲基化

3、檢測等技術(shù)對誘導(dǎo)出的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)、基因表達(dá)、OCT4甲基化修飾狀態(tài)等方面的鑒定。再利用EB懸浮培養(yǎng)法對細(xì)胞進(jìn)行體外分化，用半定量PCR檢測各胚層特有基因GATA4、AFP、RUNX1、NESTIN、NCAM的表達(dá)情況；并各取5×106個細(xì)胞注射到NOD-SCID小鼠皮下，2個月后得到畸胎瘤，行HE染色，來觀察iPS細(xì)胞在體內(nèi)的分化情況。各皮膚成纖維細(xì)胞及誘導(dǎo)出的iPS細(xì)胞均接受核型分析及短串聯(lián)重復(fù)序列分析，確認(rèn)各細(xì)胞的核型和iPS細(xì)胞

4、的來源。
　　 結(jié)果：1．各組iPS細(xì)胞AP染色均陽性，免疫熒光染色OCT4、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81均陽性，均于ES細(xì)胞相似。
　　 2．各組iPS細(xì)胞與其來源的皮膚成纖維細(xì)胞相比，OCT4基因明顯去甲基化，表明OCT4重新活化，表達(dá)量增加。
　　 3．熒光定量PCR結(jié)果提示各組iPS細(xì)胞OCT4、SOX2總表達(dá)量接近ES細(xì)胞的表達(dá)水平。而KLF4及c-MYC的總表達(dá)量則遠(yuǎn)高于ES細(xì)胞的

5、表達(dá)水平。半定量PCR提示各組iPS細(xì)胞與其來源的皮膚成纖維細(xì)胞相比，有內(nèi)源性多能性調(diào)節(jié)基因OCT4及SOX2的表達(dá)，但各轉(zhuǎn)入基因并未完全沉默。
　　 4．各組iPS細(xì)胞經(jīng)EB懸浮培養(yǎng)法行體外分化后可見三個胚層特有基因的表達(dá)。各組iPS細(xì)胞均能在NOD-SCID小鼠皮下形成畸胎瘤，經(jīng)HE染色后可觀察到三個胚層的結(jié)構(gòu)。
　　 5．短串聯(lián)重復(fù)序列分析證實各組iPS細(xì)胞均來源于相應(yīng)的皮膚成纖維細(xì)胞。核型分析證實各組iPS細(xì)胞與