UC001kfo通過(guò)調(diào)控α-SMA對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2生物學(xué)行為的影響.pdf

1、研究背景:
　　原發(fā)性肝癌是來(lái)源肝臟上皮組織的惡性腫瘤，是全球第五位最常見(jiàn)的癌癥和第三位最常見(jiàn)的癌癥死因，全世界每年約有63萬(wàn)肝癌新發(fā)病例而超過(guò)半數(shù)的新病例發(fā)生在中國(guó)[1]，目前，外科切除和肝移植仍是最有效治療早期階段肝癌的方法，盡管如此，患者五年內(nèi)手術(shù)部位復(fù)發(fā)率高達(dá)70％[2]，而腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者預(yù)后差的主要原因。嚴(yán)格的手術(shù)指征，肝臟捐贈(zèng)者的限制和高昂的成本造成肝移植只適用于少數(shù)患者。近年來(lái)，隨著高通量、高分辨的成像及

2、實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA lncRNA)與疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制的密切相關(guān)性逐漸顯現(xiàn)，尤其是lncRNA對(duì)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、增殖和凋亡等生物學(xué)行為的調(diào)控效應(yīng)備受關(guān)注[3-5]。
　　lncRNA廣泛存在于真核生物的細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中，一般長(zhǎng)度為200bp-100kb，缺乏開(kāi)放式閱讀框，不能編碼蛋白質(zhì)，起初甚至被認(rèn)為是“轉(zhuǎn)錄噪音”[6-8]，近年來(lái)，對(duì)lncRNA的研究逐漸取得進(jìn)展，有越來(lái)越多的證

3、據(jù)表明lncRNA與癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。
　　前期實(shí)驗(yàn)我們采用基因芯片技術(shù)在肝癌組織中篩選出一個(gè)肝癌相關(guān)新基因名為UC00lkfo，其長(zhǎng)度為2043bp，基因編碼區(qū)與α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（alpha smooth muscle actinα-SMA）的編碼基因ACTA2發(fā)生部分重疊，應(yīng)用基因組瀏覽器和RNAplex預(yù)測(cè) ACTA2為 UC001kfo的靶基因，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn) UC001 kfo和α-SMA在肝癌組織較癌周組織中

4、表達(dá)顯著性升高，并且在不同侵襲能力肝癌細(xì)胞中的表達(dá)量不同。后在人肝癌組織及細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上利用RT-PCR、原位雜交、免疫組化和細(xì)胞侵襲等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明UC001kfo是具有調(diào)節(jié)功能的長(zhǎng)鏈非編碼 RNA，能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移?？傊?，前期實(shí)驗(yàn)表明 UC001kfo的靶基因?yàn)?ACTA2，靶蛋白為α-SAM，UC001kfo與肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。為了更進(jìn)一步分析UC001kfo與α-SAM的相互作用機(jī)制，我們已經(jīng)采用siRNA干擾

5、技術(shù)下調(diào)UC001kfo的表達(dá)，RT-PCR的方法檢測(cè)了α-SAM的mRNA表達(dá)，采用 Western Blot的方法檢測(cè)了α-SAM的蛋白表達(dá)，結(jié)果兩者顯著相關(guān)，從mRNA和蛋白水平分別驗(yàn)證下調(diào)UC001kfo后α-SAM的表達(dá)減少[9].
　　α-SMA是肌動(dòng)蛋白的一種，后者以單體和多聚體形式存在。單體的肌動(dòng)蛋白即球狀肌動(dòng)蛋白(globular actin, G-actin)。肌動(dòng)蛋白的多聚體形成肌動(dòng)蛋白絲即纖維狀肌動(dòng)蛋白(f

6、ibros actin, F-actin)，肌動(dòng)蛋白至少表達(dá)成6種異構(gòu)形式，根據(jù)等電點(diǎn)的不同，將其分為分為α、β、γ三類(lèi)，α分布于各種肌肉細(xì)胞中，其中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白參與細(xì)胞形態(tài)的維持，參與構(gòu)成真核細(xì)胞的微絲結(jié)構(gòu)，是構(gòu)成細(xì)胞骨架和收縮構(gòu)件的主要成分，肌動(dòng)蛋白的聚合和解聚參與細(xì)胞骨架的重塑，影響細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，因此，α-SMA是調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的基礎(chǔ)[10]。另外，a-SMA是肝癌相關(guān)肌纖維母細(xì)胞(carcinoma-associated fib

7、roblasts CAF)的重要細(xì)胞成分，在肝癌細(xì)胞旁分泌機(jī)制作用下，癌旁組織成纖維細(xì)胞（paired peritumoral tissue fibroblasts PTF）表達(dá)a-SMA向CAF表型分化，結(jié)果PTF發(fā)生遷移和侵襲[11]。研究表明a-SMA、鈣黏蛋白、波形蛋白的表達(dá)還可促使上皮細(xì)胞-間充質(zhì)（ epithelial-mesenchymal transition, EMT）改變[12]，而EMT能夠通過(guò)特定程序?qū)⑸掀ぜ?xì)胞轉(zhuǎn)

8、化為具有間質(zhì)表型的細(xì)胞，如使細(xì)胞失去極性、獲得較高的降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力等，EMT主要參與生長(zhǎng)發(fā)育、損傷修復(fù)、腫瘤轉(zhuǎn)移和多種纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[13]，以細(xì)胞黏附分子表達(dá)的減少，細(xì)胞骨架中波形蛋白（Vimentin）、平滑肌蛋白表達(dá)增加以及形態(tài)上具有間充質(zhì)細(xì)胞的特征等為主要特點(diǎn)[14-15]，是上皮細(xì)胞來(lái)源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移能力的重要生物學(xué)過(guò)程[16-17]?？傊?，α-SAM通過(guò)細(xì)胞骨架重塑，構(gòu)成微絲和EMT的發(fā)生影響細(xì)胞遷移

9、，是增強(qiáng)肝癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。近年來(lái)，研究者對(duì)細(xì)胞核骨架的研究取得很大進(jìn)展，成為細(xì)胞生物學(xué)研究的一個(gè)新的生長(zhǎng)點(diǎn)，細(xì)胞核骨架是相對(duì)于細(xì)胞質(zhì)骨架而言，兩者共同構(gòu)成細(xì)胞骨架，核骨架與DNA的復(fù)制、RNA的轉(zhuǎn)錄和加工、染色體的組裝密切相關(guān)。肌動(dòng)蛋白存在于細(xì)胞核中已被證明，可能的原因之一是由胞質(zhì)肌動(dòng)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，雖然肌動(dòng)蛋白是眾所周知的在細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)行為中發(fā)揮職能，但新興的研究在強(qiáng)調(diào)肌動(dòng)蛋白的新角色，

10、一些研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)肌動(dòng)蛋白在細(xì)胞核活動(dòng)中的功能，肌動(dòng)蛋白作為核部件之一，有它自己的結(jié)構(gòu)和功能的規(guī)則，比如與核基質(zhì)，染色質(zhì)重塑，轉(zhuǎn)錄和mRNA加工相關(guān)[18]。因此，α-SAM似乎參與核轉(zhuǎn)錄調(diào)控，可能對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響。
　　本次研究采用過(guò)表達(dá)和siRNA干擾技術(shù)通過(guò)UC001kfo調(diào)控α-SMA的表達(dá)，使細(xì)胞骨架形態(tài)發(fā)生改變，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，同時(shí)使肝癌細(xì)胞發(fā)生 EMT；研究UC001kfo對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控效應(yīng)。

11、　　目的:
　　1．采用lncRNA過(guò)表達(dá)和siRNA干擾技術(shù)通過(guò)UC001kfo調(diào)控α-SMA的表達(dá)，使細(xì)胞骨架形態(tài)發(fā)生改變，探討該基因?qū)Ω伟┘?xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響。
　　2．探討UC001kfo對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響。
　　3．探討UC001kfo對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響。
　　方法:
　　以肝癌細(xì)胞株HepG2為細(xì)胞模型，在37℃5%CO2滅菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，適時(shí)傳代；實(shí)驗(yàn)分組為上調(diào)實(shí)驗(yàn)：pCDNA3.1-UC0

12、01kfo（實(shí)驗(yàn)組）、pCDNA3.1（陰性對(duì)照組）、HepG2（空白組）；下調(diào)實(shí)驗(yàn)：UC001kfo-siRNA（實(shí)驗(yàn)組）、NC-siRNA（陰性對(duì)照組）、HepG2（空白組），每組三個(gè)復(fù)孔；pCDNA3.1-UC001kfo載體前期實(shí)驗(yàn)已構(gòu)建；采用脂質(zhì)體（參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)）轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染后進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)：
　　熒光拍照檢測(cè)NC-siRNA-FAM的轉(zhuǎn)染；RT-qpCR檢測(cè)UC001kfo和α-S

13、MA的表達(dá)；免疫組化檢測(cè)細(xì)胞骨架的變化；Transwell小室實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲遷移能力；MTT和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:
　　應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，兩組定量資料比較采用t檢驗(yàn)。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　結(jié)果:
　　1、 RT-qPCR檢測(cè)UC001kfo和SMA的表達(dá)量

14、r>　?。?）UC001kfo：48h后 UC001kfo表達(dá)量 UC001kfo-pCDNA組、pCDNA組、HepG2組、UC001kfo-siRNA組、NC-siRNA組分別為1924.14±238.69、1.87±0.43、1.00±0.29、0.01±0.00、0.85±0.25。（2）α-SMA：48h后α-SMA表達(dá)量 UC001kfo-pCDNA組、pCDNA組、HepG2組、UC001kfo-siRNA組、NC-siR

15、NA組分別為6.81±1.39、0.82±0.14、1.00±0.54、0.59±0.04、1.47±0.15。T-test結(jié)果：上調(diào)實(shí)驗(yàn)（1）UC001kfo：48h后UC001kfo表達(dá)量UC001kfo-pCDNA組與pCDNA組和HepG2組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。（2）α-SMA：48h后α-SMA表達(dá)量UC001kfo-pCDNA組與pCDNA組和HepG2組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05)。下調(diào)實(shí)

16、驗(yàn)（1）UC001kfo：hUC001kfo-siRNA組與NC-siRNA組和HepG2組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（2）α-SMA：UC001kfo-siRNA組與NC-siRNA組和HepG2組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。
　　2、免疫組化IA值
　　48hUC001kfo-pCDNA組、pCDNA組、HepG2組、UC001kfo-siRNA組、NC-siRNA組分別為972.53±59.

17、10、623.11±57.66、697.98±51.29、399.03±64.47、633.94±44.44。T-test結(jié)果：上調(diào)實(shí)驗(yàn)：UC001kfo-pCDNA組與pCDNA組和HepG2組比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01)；下調(diào)實(shí)驗(yàn)：UC001kfo-siRNA組與NC-siRNA組和HepG2組比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。
　　3、Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力的變化
　　轉(zhuǎn)

18、染48h后UC001kfo-pCDNA組、pCDNA組、HepG2組、UC001kfo-siRNA組、NC-siRNA組分別為213±16.17、96±4.58、128±3.21、28±9.64、80±4.04；轉(zhuǎn)染96h后UC001kfo-pCDNA組、pCDNA組、HepG2組、UC001kfo-siRNA組、NC-siRNA組分別為201±19.09、97±5.69、116±11.53、40±3.79、72±10.21。T-tes

19、t結(jié)果：上調(diào)實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)染48h后UC001kfo-pCDNA組分別與pCDNA組和HepG2組比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；轉(zhuǎn)染96h后UC001kfo-pCDNA組分別與pCDNA組和HepG2組比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。下調(diào)實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)染48h后UC001kfo-siRNA組分別與NC-siRNA組和HepG2組比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；轉(zhuǎn)染96h后UC001kfo-siRNA組分別

20、與NC-siRNA組和HepG2組比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。
　　4、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的變化
　　轉(zhuǎn)染48h后距劃痕24h：遷移率（%）UC001kfo-pCDNA組、pCDNA組、HepG2組、UC001kfo-siRNA組、NC-siRNA組分別為32.56±5.56、31.05±7.12、35.77±7.28、25.72±5.13、32.59±3.74；距劃痕48h：UC001kfo-p

21、CDNA組、pCDNA組、HepG2組、UC001kfo-siRNA組、NC-siRNA組分別為63.57±5.58、63.41±6.04、56.77±7.54、40.76±4.74、54.76±0.57；
　　距劃痕72h：UC001kfo-pCDNA組、pCDNA組、HepG2組、UC001kfo-siRNA組、NC-siRNA組分別為98.34±2.88、87.90±0.83、92.43±2.19、、60.98±1.41、8

22、0.34±1.05。T-test
　　結(jié)果：上調(diào)實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)染48h后距劃痕24hUC001kfo-pCDNA組分別與 HepG2組和 pCDNA組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＞0.05）；距劃痕48hUC001kfo-pCDNA組與HepG2組和pCDNA組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；距劃痕72h UC001kfo-pCDNA組與HepG2組和pCDNA組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。下調(diào)實(shí)驗(yàn)：距劃痕24hUC00

23、1kfo-siRNA組分別與HepG2組和 NC-siRNA組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＞0.05）；距劃痕48hUC001kfo-siRNA組與HepG2組和NC-siRNA組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；距劃痕72hUC001kfo-siRNA組與HepG2組和NC-siRNA組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。
　　5、 MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的變化
　　1．MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示：24h時(shí)

24、pcDNA3.1-UC001kfo組、HepG2組、pCDNA組、UC001kfo-siRNA組、NC-siRNA組分別為0.72±0.02、0.67±0.04、0.71±0.02、0.56±0.04、0.7±0.02；48h時(shí) pCDNA-UC001kfo組、HepG2組、pCDNA組、UC001kfo-siRNA組、NC-siRNA組分別為1.22±0.07、1.03±0.03、1.09±0.04、0.8±0.03、0.97±0.0

25、7；96h時(shí) pCDNA-UC001kfo組、HepG2組、pCDNA組、UC001kfo-siRNA組、NC-siRNA組分別為1.63±0.07、1.39±0.07、1.47±0.03、1.05±0.04、1.38±0.02。T-test結(jié)果：上調(diào)實(shí)驗(yàn)：24hUC001kfo-pCDNA組分別與HepG2組和 pCDNA組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＞0.05）；48h時(shí)UC001kfo-pCDNA組與 pCDNA比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

26、（ P＜0.05）， UC001kfo-pCDNA組與HepG2組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；96h時(shí) UC001kfo-pCDNA組與 pCDNA比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P＜0.05）；UC001kfo-pCDNA組與HepG2組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；下調(diào)實(shí)驗(yàn)：24hUC001kfo-siRNA組分別與HepG2組和NC-siRNA組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；48h UC001kfo-si

27、RNA組與NC-siRNA組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；UC001kfo-siRNA組與HepG2組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。96hUC001kfo-siRNA組與NC-siRNA組和HepG2組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。
　　2．平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：48h時(shí)克隆集落形成率（%） pCDNA-UC001kfo組、HepG2組、pCDNA組、UC001kfo-siRNA組、NC-si

28、RNA組分別為34.94±4.24、25.73±2.32、26.80±1.91、13.20±0.92、24.40±2.31；96h時(shí)pCDNA-UC001kfo組、HepG2組、pCDNA組、UC001kfo-siRNA組、NC-siRNA組分別為40.93±4.41、30.40±5.14、25.80±3.67、13.60±1.83、22.73±1.62。
　　T-test結(jié)果：上調(diào)實(shí)驗(yàn)：48h時(shí)UC001kfo-pCDNA組與p

29、CDNA組和HepG2組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。96h時(shí)UC001kfo-pCDNA組與pCDNA組和 HepG2組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.01）；下調(diào)實(shí)驗(yàn)：48h UC001kfo-siRNA組與 NC-siRNA組和HepG2組比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；96hUC001kfo-siRNA組與NC-siRNA組和HepG2組比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。
　　6

30、、流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡變化
　　轉(zhuǎn)染48h后HepG2組、pCDNA-UC001kfo組、pCDNA組、UC001kfo-siRNA組、NC-siRNA組分別為3.5±2.36、6.3±1.15、3.7±2.76、3.83±2.46、3.53±2.28，轉(zhuǎn)染96h后HepG2組、pCDNA-UC001kfo組、pCDNA組、UC001kfo-siRNA組、NC-siRNA組分別為3.12±0.58、4.97±1.16、4.03±1.

31、04、2.3±0.56、3.6±1.78。T-test結(jié)果：上調(diào)實(shí)驗(yàn)：48h、96h pCDNA-UC001kfo組分別與pCDNA組、HepG2組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；下調(diào)實(shí)驗(yàn)：48h、96h pCDNA-siRNA組分別與siRNA組、HepG2組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1．UC001kfo通過(guò)調(diào)控a-SMA促進(jìn)肝癌細(xì)胞偽足形成，細(xì)胞骨架增多，更易于肝癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，