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文檔簡介
1、目的:
膜聯(lián)蛋白a2(Annexina2,Anxa2)是一種鈣離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白,在侵襲性腫瘤中表達明顯增高。前期研究結(jié)果提示與親本細胞相比,有多藥耐藥表型的乳腺癌細胞的遷移能力明顯提高,Anxa2可能是一個與腫瘤的耐藥和轉(zhuǎn)移雙重表型相關(guān)的重要分子。本研究通過提高乳腺癌細胞中Annexina2的表達和降低耐藥乳腺癌細胞中Annexina2的表達的干預實驗研究,觀察Annexina2的表達對乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的影
2、響,并進一步探索Annexina2參與調(diào)節(jié)耐藥乳腺癌細胞遷移及侵襲的分子機制。
方法:
1.應用基因克隆技術(shù)增高人乳腺癌MCF-7細胞中Annexina2蛋白的表達水平;RNA干擾技術(shù)降低其多藥耐藥MCF-7/ADR細胞中Annexina2蛋白的表達水平,并分別用Westernblotting技術(shù)對蛋白表達量進行檢測。
2.低劑量(0.01μM)阿霉素作用MCF-7細胞,觀察其Annexina2表達量的變化
3、。
3.應用測定細胞生長曲線實驗檢測Annexina2的高表達對MCF-7細胞增殖能力的影響。
4.應用克隆形成實驗檢測Annexina2的高表達對MCF-7細胞克隆形成能力的影響。
5.采用流式細胞術(shù)檢測Annexina2高表達對MCF-7細胞周期分布的改變。
6.應用劃痕實驗檢測Annexina2高表達對MCF-7細胞的遷移能力的影響。
7.采用體外遷移、侵襲實驗檢測Annexina
4、2的高表達對MCF-7細胞的體外遷移、侵襲能力的影響。
8.建立動物模型,觀察檢測Annexina2的表達對耐藥乳腺癌MCF-7/ADR細胞在體內(nèi)成瘤速度及成瘤率的變化。
9.應用Westernblotting技術(shù)檢測A2蛋白表達量變化對周期相關(guān)蛋白表達水平的影響及ERK通路的激活情況,進一步明確Annexina2調(diào)控乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的分子機制。
結(jié)果:
1.構(gòu)建真核細胞融合表達載體pc
5、DNA3.1-Anxa2,將該載體轉(zhuǎn)染MCF-7細胞,篩選到三株單克隆細胞株,與親本細胞相比,A2的表達量增高三倍以上;應用RNA干擾技術(shù)轉(zhuǎn)染人乳腺癌MCF-7/ADR細胞后篩選得到Annexina2蛋白表達水平下降80%-100%的2株單克隆細胞。
2.Annexina2表達水平上升后MCF-7細胞增殖能力顯著增強(P<0.05)。
3.Annexina2基因高表達后MCF-7細胞克隆形成能力顯著提高(P<0.01
6、)。
4.Annexina2表達水平提高導致MCF-7細胞的增殖指數(shù)上升,細胞周期G0/G1期比例下降,G2/M+S期比例顯著提高(P<0.05)。
5.劃痕實驗發(fā)現(xiàn)Annexina2高表達后乳腺癌MCF-7細胞的遷移能力顯著增強(P<0.05)。
6.體外侵襲實驗結(jié)果表明Annexina2高表達后細胞的體外侵襲能力顯著提高(P<0.01)。
7.體內(nèi)實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)Annexina2降表達后明顯抑制
7、了乳腺癌MCF-7/ADR細胞的增殖(P<0.05)。
8.Westernblotting技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)MCF-7細胞中Annexina2高表達后C-myc、CyclinD1的表達水平明顯提高,Annexina2基因降表達后C-myc、CyclinD1的表達水平顯著下降;并發(fā)現(xiàn)Annexina2有可能通過參與ERK通路的激活過程。
結(jié)論:
1.Annexina2表達水平增高后,MCF-7細胞的增殖能力和克隆形
8、成能力提高,細胞增殖指數(shù)上升,細胞周期分布G0/G1期比例下降,G2/M+S期比例顯著升高。Annexina2表達水平上升后C-myc和CyclinD1的表達水平增高,表明Annexina2通過影響C-myc和CyclinD1的表達水平從而調(diào)節(jié)乳腺癌細胞的增殖過程。
2.Annexina2基因高表達后,MCF-7細胞的遷移能力顯著提高,體外侵襲能力明顯增強。
3.Annexina2基因沉默后MCF-7/ADR細胞的體
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