Annexin a2參與耐藥乳腺癌細胞遷移及侵襲的分子機制研究.pdf

1、目的：
　　膜聯(lián)蛋白a2(Annexina2，Anxa2)是一種鈣離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白，在侵襲性腫瘤中表達明顯增高。前期研究結(jié)果提示與親本細胞相比，有多藥耐藥表型的乳腺癌細胞的遷移能力明顯提高，Anxa2可能是一個與腫瘤的耐藥和轉(zhuǎn)移雙重表型相關(guān)的重要分子。本研究通過提高乳腺癌細胞中Annexina2的表達和降低耐藥乳腺癌細胞中Annexina2的表達的干預實驗研究，觀察Annexina2的表達對乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的影

2、響，并進一步探索Annexina2參與調(diào)節(jié)耐藥乳腺癌細胞遷移及侵襲的分子機制。
　　方法：
　　1.應用基因克隆技術(shù)增高人乳腺癌MCF-7細胞中Annexina2蛋白的表達水平；RNA干擾技術(shù)降低其多藥耐藥MCF-7/ADR細胞中Annexina2蛋白的表達水平，并分別用Westernblotting技術(shù)對蛋白表達量進行檢測。
　　2.低劑量(0.01μM)阿霉素作用MCF-7細胞，觀察其Annexina2表達量的變化

3、。
　　3.應用測定細胞生長曲線實驗檢測Annexina2的高表達對MCF-7細胞增殖能力的影響。
　　4.應用克隆形成實驗檢測Annexina2的高表達對MCF-7細胞克隆形成能力的影響。
　　5.采用流式細胞術(shù)檢測Annexina2高表達對MCF-7細胞周期分布的改變。
　　6.應用劃痕實驗檢測Annexina2高表達對MCF-7細胞的遷移能力的影響。
　　7.采用體外遷移、侵襲實驗檢測Annexina

4、2的高表達對MCF-7細胞的體外遷移、侵襲能力的影響。
　　8.建立動物模型，觀察檢測Annexina2的表達對耐藥乳腺癌MCF-7/ADR細胞在體內(nèi)成瘤速度及成瘤率的變化。
　　9.應用Westernblotting技術(shù)檢測A2蛋白表達量變化對周期相關(guān)蛋白表達水平的影響及ERK通路的激活情況，進一步明確Annexina2調(diào)控乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的分子機制。
　　結(jié)果:
　　1.構(gòu)建真核細胞融合表達載體pc

5、DNA3.1-Anxa2，將該載體轉(zhuǎn)染MCF-7細胞，篩選到三株單克隆細胞株，與親本細胞相比，A2的表達量增高三倍以上；應用RNA干擾技術(shù)轉(zhuǎn)染人乳腺癌MCF-7/ADR細胞后篩選得到Annexina2蛋白表達水平下降80％-100％的2株單克隆細胞。
　　2.Annexina2表達水平上升后MCF-7細胞增殖能力顯著增強(P<0.05)。
　　3.Annexina2基因高表達后MCF-7細胞克隆形成能力顯著提高(P<0.01

6、)。
　　4.Annexina2表達水平提高導致MCF-7細胞的增殖指數(shù)上升，細胞周期G0/G1期比例下降，G2/M+S期比例顯著提高(P<0.05)。
　　5.劃痕實驗發(fā)現(xiàn)Annexina2高表達后乳腺癌MCF-7細胞的遷移能力顯著增強(P<0.05)。
　　6.體外侵襲實驗結(jié)果表明Annexina2高表達后細胞的體外侵襲能力顯著提高(P<0.01)。
　　7.體內(nèi)實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)Annexina2降表達后明顯抑制

7、了乳腺癌MCF-7/ADR細胞的增殖(P<0.05)。
　　8.Westernblotting技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)MCF-7細胞中Annexina2高表達后C-myc、CyclinD1的表達水平明顯提高，Annexina2基因降表達后C-myc、CyclinD1的表達水平顯著下降；并發(fā)現(xiàn)Annexina2有可能通過參與ERK通路的激活過程。
　　結(jié)論：
　　1.Annexina2表達水平增高后，MCF-7細胞的增殖能力和克隆形

8、成能力提高，細胞增殖指數(shù)上升，細胞周期分布G0/G1期比例下降，G2/M+S期比例顯著升高。Annexina2表達水平上升后C-myc和CyclinD1的表達水平增高，表明Annexina2通過影響C-myc和CyclinD1的表達水平從而調(diào)節(jié)乳腺癌細胞的增殖過程。
　　2.Annexina2基因高表達后，MCF-7細胞的遷移能力顯著提高，體外侵襲能力明顯增強。
　　3.Annexina2基因沉默后MCF-7/ADR細胞的體