ShRNA干擾沉默Amh基因?qū)w外培養(yǎng)小鼠卵巢顆粒細(xì)胞的局部調(diào)節(jié)機(jī)制研究.pdf

1、抗苗勒管激素(Anti-Müllerian hormone，AMH)是由兩個(gè)72kDa的單體通過二硫鍵連接構(gòu)成的二聚體糖蛋白。AMH/MIS屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)超家族，該家族包括TGF-β、激活素-抑制素-卵泡抑素(ACT-INH-FST)系統(tǒng)和生長(zhǎng)分化因子-9(GDF-9)等。這個(gè)家族所有的成員都是二聚體糖蛋白，都與調(diào)節(jié)組織生長(zhǎng)與分化有關(guān)?，F(xiàn)已證實(shí)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)超家族/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是調(diào)控卵泡發(fā)育的

2、重要途徑。在卵巢組織中，抗苗勒管激素表達(dá)于卵泡的顆粒細(xì)胞。已知抗苗勒管激素參與哺乳動(dòng)物卵泡發(fā)育，通過自/旁分泌調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的增殖分化，為了研究抗苗勒管激素對(duì)小鼠卵巢顆粒細(xì)胞的調(diào)控作用，本課題針對(duì)小鼠基因序列設(shè)計(jì)干擾片段，構(gòu)建了抗苗勒管激素RNAi干擾載體pSilencer4.1-CMV-AMH，干擾顆粒細(xì)胞中抗苗勒管激素的表達(dá)，分別在mRNA和蛋白水平檢測(cè)抗苗勒管激素的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在干擾抗苗勒管激素后，顆粒細(xì)胞內(nèi)發(fā)生如下變化:

3、　　1)通過Western blot檢測(cè)構(gòu)建的三個(gè)抗苗勒管激素RNAi干擾載體，三個(gè)載體都顯著下調(diào)抗苗勒管激素的蛋白表達(dá)，其中干擾載體psh-AMH-2的干擾效果最好;
　　2)流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠顆粒細(xì)胞干擾抗苗勒管激素后的細(xì)胞周期，發(fā)現(xiàn)較多的細(xì)胞阻滯在G1期。調(diào)控細(xì)胞周期的p21在mRNA和蛋白水平表達(dá)都顯著上調(diào);
　　3)流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠顆粒細(xì)胞干擾抗苗勒管激素后的細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡都顯著增加。通過R

4、eal time PCR和Western blot檢測(cè)抑制凋亡的Bcl-2表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Bcl-2的表達(dá)顯著下調(diào);
　　4)CCK-8法檢測(cè)顆粒細(xì)胞的增殖，干擾抗苗勒管激素后顆粒細(xì)胞的增殖降低;
　　5)ELISA檢測(cè)顆粒細(xì)胞分泌雌激素和抑制素B的濃度，抑制素B分泌顯著降低，雌激素也顯著降低;
　　6)通過Real time PCR檢測(cè)干擾后顆粒細(xì)胞中TGF-β超家族的抑制素各亞基(INHA、INHBA和INHBB)、