成人髓核細胞特征性表達基因的篩選與驗證.pdf

1、研究背景及目的:
　　腰痛已成為現(xiàn)代社會中困擾人們生活的主要疾病。據(jù)研究調(diào)查顯示,腰椎間盤退行性病變是引起腰痛的主要原因。目前,研究認為腰椎壓應(yīng)力增加,營養(yǎng)供給減弱以及遺傳易感性增加是腰椎間盤發(fā)生退行性改變的主要原因。
　　椎間盤由三部分組成。在椎間盤的外周部位為致密的纖維環(huán),其中央部位是膠凍狀的髓核組織,以及緊貼于上下椎體表面的終板軟骨。椎間盤的生理作用主要是通過髓核內(nèi)的蛋白多糖以及Ⅱ型膠原與水分子結(jié)合后產(chǎn)生的靜水壓傳導(dǎo)和

2、抵抗壓力。腰椎間盤可為腰椎提供一定的活動度,維持腰椎在各個方向上的活動。而髓核周圍的纖維環(huán)則可限制內(nèi)部髓核組織的移動。由于腰椎間盤缺乏血管供應(yīng),其主要營養(yǎng)供給主要依靠上下椎體通過軟骨終板的滲透作用。在腰椎退行性改變中,位于腰椎間盤上下面的終板軟骨首先發(fā)生鈣化,引起營養(yǎng)滲透作用的減弱,從而導(dǎo)致腰椎間盤內(nèi)的細胞無法得到充分的營養(yǎng)供給而發(fā)生退變。而且,腰椎間盤壓應(yīng)力增加可導(dǎo)致髓核內(nèi)基質(zhì)成分的變化,從而減弱其對抗重力的作用。
　　目前腰椎

3、間盤退行性疾病的治療手段多種多樣,其中主要包括保守治療和外科手術(shù)治療。保守治療主要針對疼痛或麻木感不明顯的患者,主要有物理治療,如按摩、牽引和服用塞來昔布等NSAIDS類藥物。但是,如經(jīng)三個月到半年的正規(guī)保守治療無效,則需要進行外科手術(shù)。目前主要的外科手術(shù)方式包括髓核摘除術(shù)和腰椎融合術(shù)等。但是,無論哪種術(shù)式,均是以犧牲患者運動節(jié)段的方式緩解癥狀,并無法恢復(fù)正常的脊柱運動功能。所以,目前對于腰椎退行性疾病的治療手段都存在明顯缺陷。

4、　　近年來,細胞移植技術(shù)和組織工程技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展,有望為退變椎間盤疾病提供生物修復(fù)可能。已有動物研究證實,首先將髓核細胞進行體外培養(yǎng),然后將經(jīng)富集的細胞移植入受損的椎間盤內(nèi),通過觀察椎間盤高度與其生物力學(xué)特性發(fā)現(xiàn),此方法可以修復(fù)受損的椎間盤。
　　然而,由于髓核組織內(nèi)數(shù)量較少,且來源較少,在一定程度上限制了髓核組織工程的發(fā)展。已有多項研究表明,將BMSC與髓核細胞共培養(yǎng)后移植入椎間盤內(nèi)后也可達到治療受損椎間盤的作用。以干細胞為基

5、礎(chǔ)的髓核組織工程解決了上述問題。
　　但是,由于現(xiàn)在尚缺乏髓核細胞特征性表達基因,這限制了干細胞向髓核細胞誘導(dǎo)分化后細胞的分離和鑒定,進而也限制了細胞治療椎間盤退行性疾病的研究。一直以來,由于其在形態(tài)和功能上與軟骨細胞相似,髓核細胞均視為“類軟骨細胞”,所以一直采用Sox-9和COL2A1等軟骨細胞標(biāo)志物鑒定髓核細胞。但是,無論從胚胎發(fā)生、組織分類以及細胞外基質(zhì)成分上來看,這兩種細胞都有較大差異。所以,理論上,髓核細胞應(yīng)有與軟骨細

6、胞不同的基因表達譜。
　　迄今為止,僅有少量關(guān)于髓核細胞特征性表型的研究。Fujita,Sakei,Minogue等人分別在大鼠、犬以及牛的髓核細胞中發(fā)現(xiàn)了其標(biāo)志物。但是由于物種差異,以及脊柱形態(tài)的差異,此研究結(jié)果并不能直接用于人體內(nèi)。Power等通過人體標(biāo)本發(fā)現(xiàn)CAⅫ可用作鑒定人髓核細胞,但是由于其樣本量少,且樣本為退變的髓核細胞,所以此結(jié)果也有待進一步研究商榷。
　　研究方法與結(jié)果:
　　本實驗首先通過取10對脊柱

7、骨折內(nèi)固定患者的健康髓核與終板軟骨組織,分別對髓核細胞與終板軟骨細胞進行單層培養(yǎng)后,進行微陣列基因芯片分別分析其表達譜,并初步比較兩種細胞的基因表達譜的差別。隨后,用同樣的標(biāo)本對芯片中表達差異較大的基因進行Real-time PCR準確定量其在mRNA水平的表達。然后使用Western blot在另外3對髓核細胞與終板軟骨細胞中對表達差異較大的基因進行蛋白水平定量分析。最后取1對標(biāo)本分別對表達差異最大的蛋白進行免疫細胞化學(xué)分析,并采用髓

8、核細胞和終板軟骨細胞分別與BMSC共培養(yǎng)后同樣進行免疫細胞化學(xué)驗證此蛋白在兩種細胞中的表達。
　　結(jié)果:
　　在微陣列基因芯片中,發(fā)現(xiàn)有15個基因在髓核細胞中的表達顯著高于軟骨細胞。然后通過Real-time PCR,我們發(fā)現(xiàn)有三個基因(POTEB,ROBO4以及EGR4)在髓核細胞中與軟骨細胞中的表達有明顯差異。其中,POTEB的表達差異倍數(shù)最高。在Western blot中,我們發(fā)現(xiàn)POTEB在兩種細胞間的表達存在明顯差