索拉非尼與5-FU聯(lián)合用藥模式對(duì)人肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用及其機(jī)制的初步探討.pdf

1、目的:
　　觀察分子靶向藥物索拉非尼與常用化療藥物5-氟尿嘧啶（5-FU）聯(lián)用模式對(duì)人肝癌細(xì)胞株MHCC97H和SMMC-7721的增殖抑制作用，并初步探討其可能機(jī)制。
　　方法:
　　分別以人肝癌細(xì)胞系MHCC97H細(xì)胞和SMMC-7721細(xì)胞為靶細(xì)胞;以索拉非尼和5-FU作為細(xì)胞的干預(yù)藥物;以分別單獨(dú)用藥、不同給藥順序的聯(lián)合用藥等方式干預(yù)細(xì)胞。用CCK-8方法檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用;參考中效原理的方法計(jì)算兩藥

2、聯(lián)用的聯(lián)合指數(shù)(CI);應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞周期的影響;采用免疫印跡法(Western Blot，WB)檢測(cè)增殖相關(guān)信號(hào)通路RAF/MEK/ERK和STAT3的相關(guān)蛋白，以及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclinD1的表達(dá)。運(yùn)用載有特異性發(fā)夾RNA(shRNA)的慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)特異性沉默MHCC97H細(xì)胞株的c-Raf基因，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)和Western Blot兩種方法，分別從mRNA水平和蛋白水平檢測(cè)c-Raf

3、基因沉默的效果，觀察c-Raf基因沉默后細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期以及相關(guān)信號(hào)通路活性的變化。
　　結(jié)果:
　　(1)藥物對(duì)肝癌細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50):
　　藥物對(duì)人肝癌細(xì)胞MHCC97H和SMMC-7721的ICS0分別為:索拉非尼分別為(17.82±2.04)μM和(15.52±0.95)μM;5-FU分別為(116.59±62.04)mg/L和(47.19±13.02)mg/L。兩種藥物對(duì)兩種細(xì)胞均有明顯的抑制作

4、用，且呈濃度依賴性。
　　(2)聯(lián)合用藥的給藥順序與細(xì)胞抑制作用:
　　聯(lián)合用藥對(duì)兩種細(xì)胞的增殖均有明顯抑制作用，但抑制作用的強(qiáng)度與兩藥給藥的先后順序有關(guān)。5-FU單藥組對(duì)MHCC97H和SMMC-7721細(xì)胞的抑制率分別為(33.30±5.67)％和（29.65±4.74）％。以此為對(duì)照基準(zhǔn)，當(dāng)兩藥同時(shí)給藥時(shí)，抑制率分別為（29.87±8.83）％(p=0.328)和（30.35±4.86）％(p=0.781);當(dāng)先行5-

5、FU預(yù)處理后再予索拉非尼，則抑制率分別為（42.57±3.29）％(p=0.017)和（53.50±1.97）％(p＜0.001);而先行索拉非尼預(yù)處理后再予5-FU，則抑制率分別為（22.98±5.93）％(p=0.023)和（23.23±4.43）％(p=0.016)。
　　(3)聯(lián)合指數(shù)(CI)評(píng)價(jià)兩藥的聯(lián)合應(yīng)用效果:
　　參考中效原理的方法計(jì)算兩藥聯(lián)用的聯(lián)合指數(shù)(CI)，當(dāng)CI＞1時(shí)，提示兩藥產(chǎn)生拮抗作用;當(dāng)CI＜1

6、時(shí)，提示兩藥產(chǎn)生協(xié)同作用，當(dāng)CI=1時(shí)，提示兩藥產(chǎn)生疊加作用。
　　聯(lián)合用藥干預(yù)MHCC97H細(xì)胞時(shí)，聯(lián)合指數(shù)（CI值）分別于兩藥同時(shí)應(yīng)用組為4.33±1.73、2.07±0.44、1.47±0.25、1.18±0.28和0.99±0.40;5-FU預(yù)處理組為3.88±1.73、5.20±2.17、3.25±2.57、1.13±0.27和0.75±0.15;索拉非尼預(yù)處理組為32.84±4.26、9.70±3.96、3.69±2.

7、08、2.33±1.24和1.26±0.30。提示，無論何種加藥順序，CI值均大于1，即產(chǎn)生拮抗作用;但5-FU預(yù)處理組的CI值比索拉非尼預(yù)處理組小，而且在較高藥物濃度時(shí)，其CI值已經(jīng)接近甚至小于1，提示兩藥產(chǎn)生疊加甚或協(xié)同作用。
　　聯(lián)合用藥干預(yù)SMMC-7721細(xì)胞時(shí)，聯(lián)合指數(shù)（CI值）分別于兩藥同時(shí)應(yīng)用組為112.45±28.23、1.95±1.01、1.33±0.38、1.45±0.33和1.02±0.09;5-FU預(yù)處理

8、組為13.63±9.81、0.50±0.34、0.41±0.20、0.38±0.05和0.40±0.04;索拉非尼預(yù)處理組為67.40±15.67、13.50±9.43、1.80±0.11、1.66±0.17和1.71±0.06。提示，索拉非尼和5-FU同時(shí)作用、或索拉非尼預(yù)處理后再加5-FU，兩藥都表現(xiàn)為拮抗作用;而5-FU預(yù)處理后再加索拉非尼則兩藥產(chǎn)生明顯協(xié)同作用。
　　(4)聯(lián)合用藥的給藥順序與肝癌細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性:<

9、br>　　與索拉非尼（8μM）聯(lián)用時(shí)，兩種肝癌細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性隨著兩藥加藥順序的不同而有較明顯的變化。5-FU單藥處理MHCC97H和SMMC-7721細(xì)胞，其IC50值分別為（116.59±62.04）mg/L和（47.19±13.02）mg/L。以此為對(duì)照基準(zhǔn)，當(dāng)索拉非尼預(yù)處理后，兩種細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性明顯降低，表現(xiàn)為5-FU的IC50值顯著增加，分別為（477.46±146.45）mg/L和（1371.26±237.70

10、）mg/L，P＜0.001。相反，當(dāng)細(xì)胞先用5-FU預(yù)處理后再加入索拉非尼時(shí)，細(xì)胞對(duì)5-FU的IC50值則明顯下降，分別為（25.45±9.72）mg/L(P=0.042)和（9.47±1.03）mg/L(P=0.568)。
　　(5)索拉非尼對(duì)細(xì)胞周期的影響:
　　當(dāng)兩種肝癌細(xì)胞單用索拉非尼處理、或先用索拉非尼預(yù)處理后再加入5-FU，細(xì)胞均出現(xiàn)G1期阻滯，表現(xiàn)為G1期細(xì)胞增加，S期細(xì)胞減少。兩種給藥方式下，MHCC97H的

11、G1期細(xì)胞由（47.53±0.06）％分別增加至（63.03±0.95）％和(66.70±0.30)％，P＜0.001;S期細(xì)胞由(40.97±0.15)％分別下降至(17.43±0.85)％和（12.27±0.45）％，P＜0.001。SMMC-7721的G1期細(xì)胞由（63.83±1.94）％分別增加至(70.07±0.70)％和(81.83±0.35)％，P＜0.001;S期細(xì)胞由（27.17±2.41）％分別下降至(8.45±1.

12、03)％和（9.23±0.12）％，P＜0.001。
　　(6)索拉非尼和/或5-FU對(duì)細(xì)胞信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響:
　　兩種肝癌細(xì)胞MHCC97H和SMMC-7721的p-c-Raf、p-ERK和p-Stat3三種蛋白的表達(dá)，與空白對(duì)照組比較，索拉非尼單用組分別為（0.47±0.10）倍、(0.47±0.05)倍、(0.38±0.05)倍和(0.47±0.12)倍、（0.54±0.03）倍、（0.51±0.02）倍，P

13、值均＜0.001;兩藥同時(shí)作用組分別為(0.43±0.07)倍、（0.45±0.05）倍、（0.38±0.02）倍和(0.40±0.07)倍、（0.66±0.09）倍、(0.63±0.06)倍，P值均＜0.001;索拉非尼預(yù)處理組分別為（0.68±0.12）倍、（0.64±0.04）倍、（0.43±0.06）倍和(0.64±0.04)倍、(0.77±0.03)倍、（0.82±0.03）倍，P值均＜0.001;5-FU預(yù)處理組分別為(0.

14、61±0.18)倍、（0.54±0.01）倍、（0.40±0.05）倍和(0.61±0.05)倍、（0.63±0.05）倍、(0.78±0.06)倍，P值均＜0.001;5-FU單用組分別為（0.95±0.065）倍、（0.96±0.04）倍、（0.96±0.03）倍和（0.93±0.06）倍、（1.06±0.12）倍、（0.95±0.06）倍，p值均＞0.05。提示，索拉非尼單獨(dú)、或與5-FU聯(lián)用均能明顯下調(diào)人肝癌細(xì)胞上述三種蛋白的表

15、達(dá)。而5-FU單用時(shí)，三種蛋白表達(dá)的表達(dá)量無明顯變化。
　　兩種肝癌細(xì)胞MHCC97H和SMMC-7721的cyclinD1蛋白表達(dá)，與空白對(duì)照組比較，索拉非尼單用組分別（0.56±0.05）倍和（0.53±0.08）倍，(P=0.002和P＜0.001);兩藥同時(shí)作用組分別為（0.64±0.12）倍和（0.57±0.04）倍，(p=0.008和p＜0.001);索拉非尼預(yù)處理組分別為（0.70±0.09）倍和（0.89±0.07

16、）倍，(p=0.023和p=0.174);5-FU預(yù)處理組分別為（0.61±0.07）倍和（0.76±0.05）倍，(p=0.004和P=0.008)。而5-FU單用時(shí)分別為（1.55±0.29）倍和（1.83±0.18）倍，(p值均＜0.001)。提示，索拉非尼單用、兩藥聯(lián)用均能明顯下調(diào)兩種細(xì)胞cyclin D1蛋白的表達(dá)，但后者程度較前者弱;而5-FU單用則出現(xiàn)相反的結(jié)果，表現(xiàn)為cyclin D1蛋白表達(dá)的明顯增加。說明兩藥聯(lián)用時(shí)對(duì)

17、cyclin D1的調(diào)控以索拉非尼的作用占優(yōu)勢(shì)。
　　(7) c-Raf基因沉默后肝癌細(xì)胞對(duì)5-FU敏感性的改變:
　　野生型MHCC97H細(xì)胞對(duì)5-FU的IC50值為（116.59±62.04 mg/L），與之比較，c-Raf基因沉默細(xì)胞的IC50值為（195.61±16.86）mg/L，有所升高，p=0.044;而索拉非尼預(yù)處理后的野生型細(xì)胞的IC50值為（477.46±146.45）mg/L，與c-Raf基因沉默細(xì)胞比

18、較，明顯升高，p＜0.001。提示，c-Raf基因在索拉非尼引起的肝癌細(xì)胞對(duì)5-FU敏感性降低中起到關(guān)鍵性作用，但可能并不是唯一的作用通路。
　　(8)肝癌細(xì)胞c-Raf基因沉默后的細(xì)胞周期變化:
　　c-Raf基因沉默的MHCC97H細(xì)胞與野生型細(xì)胞相比，處于G1期的細(xì)胞比例明顯增加，由（47.53±0.06）％增加到（57.40±0.30）％，p＜0.001;S期的細(xì)胞比例明顯減少，由（40.97±0.15）％減少至(2

19、0.20±0.40)％，p＜0.001;與索拉非尼的作用相似。提示，索拉非尼對(duì)肝癌細(xì)胞細(xì)胞周期分布的影響可能與RAF/MEK/ERK通路相關(guān)。
　　(9)肝癌細(xì)胞c-Raf基因沉默后的信號(hào)通路:
　　c-Raf基因沉默的肝癌細(xì)胞，其磷酸化C-RAF、總C-RAF、磷酸化ERK蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)，分別是野生型細(xì)胞的（0.37±0.02）倍、（0.40±0.05）倍和（0.41±0.03）倍;p＜0.001;其cyclin D1

20、蛋白表達(dá)也明顯下調(diào)，是野生型細(xì)胞的（0.46±0.04）倍，p＜0.001;而磷酸化STAT3、總STAT3蛋白的表達(dá)沒有明顯變化，分別為野生型細(xì)胞的（0.99±0.08）倍和（0.99±0.05）倍，(p=0.793和p=0.659)。提示，c-Raf基因沉默能明顯阻斷細(xì)胞的RAF/MEK/ERK信號(hào)通路;其cyclin D1蛋白表達(dá)下調(diào)與索拉非尼的作用相一致;而c-Raf基因沉默細(xì)胞與野生型細(xì)胞的磷酸化STAT3、總STAT3蛋白的

21、表達(dá)沒有明顯變化，說明，索拉非尼引起的STAT3蛋白表達(dá)下調(diào)是非RAF/MEK/ERK通路依賴的。
　　結(jié)論:
　　索拉非尼和5-FU單獨(dú)或聯(lián)用對(duì)肝癌細(xì)胞均有顯著的增殖抑制作用，但兩藥聯(lián)合應(yīng)用的效果與加藥順序密切相關(guān):5-FU是S期特異性的細(xì)胞毒藥物，若5-FU在索拉非尼作用后再加入，索拉非尼可能在阻斷RAF/MEK/ERK信號(hào)通路以及STAT3相關(guān)通路的雙重作用下，抑制了細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞