Mfn2基因抑制血管平滑肌細胞增殖的功能序列及肽研究.pdf

1、第一部分 攜帶Mfn2基因不同結構序列的重組腺病毒的構建、擴增和純化
　　 1.目的
　　 采用DNA重組技術，構建、制備、鑒定、擴增和純化含線粒體融合素2基因（Mitofusin 2，Mfn2）不同結構序列的重組腺病毒。
　　 2.方法
　　 利用聚合酶鏈反應（PCR）擴增大鼠Mfn2不同區(qū)段的互補DNA（cDNAs），將PCR產物連接到TA克隆載體（pCR8/GW/TOPO）上，篩選出含有正確片段的質

2、粒。利用Gateway方法將含有正確片段的重組質粒與腺病毒目的質粒（pAd/CMV/V5-DEST），在LR Clonase的幫助下進行重組反應。用PacI將所得到的重組腺病毒載體切開，再利用脂質體（Lipofectamine 2000）包裝后轉染到293細胞中，產生重組的腺病毒。經測序鑒定無誤后進行大量擴增，利用氯化銫密度梯度離心法，超高速離心純化病毒，分裝凍存于-80 ℃中。用紫外分光光度儀測定病毒液光密度（OD）值，計算病毒滴度。

3、采用Western blot方法檢測目的基因在大鼠血管平滑肌細胞（VSMCs）中的表達。
　　 3.結果
　　 8種目的基因結構序列（1A、2A、3A、4A、5A、6A、7A、8A）正確，通過PCR鑒定可檢測到相應條帶。8種重組腺病毒的滴度分別為27.8×109 pfu/ml、24×109 pfu/ml、19×109 pfu/ml、30.8×109 pfu/ml、6.7×109 pfu/ml、12.7×109 pfu/m

4、l、27.6×109 pfu/ml、11.8×109 pfu/ml。Western blot檢測結果顯示相應的Mfn2蛋白表達。
　　 4.結論
　　 利用DNA重組技術可成功構建攜帶Mfn2基因不同結構序列的重組腺病毒，并通過擴增和純化獲得大量高滴度的病毒液，為進一步研究其對VSMCs增殖和凋亡的影響奠定了基礎。
　　 第二部分 Mfn2基因不同結構序列對血管平滑肌細胞增殖和凋亡的影響
　　 1.目的<

5、br>　　 研究大鼠線粒體融合素2基因（Mfn2）不同結構序列對大鼠血管平滑肌細胞（VSMCs）增殖和凋亡的影響，尋找能有效抑制VSMCs增殖和促進凋亡的最小cDNA（scDNA），并探討其相關的信號通路。
　　 2.方法
　　 利用攜帶Mfn2基因不同結構序列的重組腺病毒感染大鼠VSMCs。采用細胞計數(shù)法、水溶性四氮唑鹽（WST-8，CCK-8）法比較其對VSMCs增殖的影響；流式細胞術比較各組細胞周期的變化；流式細

6、胞術和細胞凋亡ELISA觀察各組對VSMCs凋亡的影響；Western blot法分析各組磷酸化Raf-1（p-Raf-1）、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）、磷酸化Akt（p-Akt）蛋白表達的變化。
　　 3.結果
　　 細胞計數(shù)和CCK-8結果顯示，與對照組相比，Mfn2基因不同結構序列對VSMCs的增殖均有不同程度的抑制作用，其中以1A、4A和8A的抑制效果最明顯；流式細胞儀細胞周期檢測結果表明，Mfn2基

7、因不同結構序列較對照組均能不同程度使VSMCs生長停滯于G0/G1期，其中以1A、4A和8A最為明顯，進入S期的細胞比例分別為（59.85±3.26）％、（34.73±2.65）％和（60.73±2.69）％；流式細胞儀Annexin V-FITC細胞凋亡檢測結果表明，與對照組相比，1A、4A和8A均有明顯的促VSMCs凋亡作用，且呈時間依賴性（48h-72h）；細胞凋亡ELISA結果顯示，與對照組相比，1A、4A和8A 均有顯著的促V

8、SMCs凋亡作用；Western blot檢測結果顯示，1A、4A和8A的p-Raf-1、p-ERK1/2和p-Akt表達水平較對照組均有明顯降低。
　　 4.結論
　　 與Mfn2全長序列（8A，Adv-Mfn2）和去除穿膜區(qū)的Mfn2序列（4A，Adv-tMfn2）相比，Mfn2最小結構序列1A同樣具有顯著抑制VSMCs增殖的作用，使細胞周期停滯于G0/G1期，這一作用主要是使Ras-Raf-ERK1/2通路受到抑制

9、，p-Raf-1和p-ERK1/2的表達下調，從而發(fā)揮抑制血管平滑肌細胞增殖的作用。此外，1A也具有促VSMCs凋亡的作用，該作用主要是通過抑制Ras-PI3K-Akt信號通路而實現(xiàn)。
　　 第三部分Mfn2基因相關合成肽對血管平滑肌細胞增殖和凋亡的影響
　　 1.目的
　　 研究Mfn2基因相關合成肽（MRSP）對大鼠血管平滑肌細胞（VSMCs）增殖和凋亡的影響，并探討其相關的信號通路。
　　 2.方法

10、
　　 在Mfn2最小功能序列1A的C端加上TAT穿膜多肽，人工合成MRSP。采用細胞計數(shù)法、水溶性四氮唑鹽（WST-8，CCK-8）法觀察不同濃度的MRSP（1 μM、10μM、25μM、50μM、100μM）對VSMCs增殖的影響；流式細胞術比較不同濃度MRSP對VSMCs細胞周期的影響；細胞凋亡ELISA和流式細胞術觀察MRSP對VSMCs凋亡的影響；Western blot法分析各組磷酸化Raf-1（p-Raf-1）、磷

11、酸化ERK1/2（p-ERK1/2）、磷酸化Akt（p-Akt）蛋白表達的變化。
　　 3.結果
　　 人工合成MRSP為白色凍干粉末，純度97.2％，分子量3305，水溶性良好（PBS中的溶解度為1mg/ml）。細胞計數(shù)和CCK-8結果均顯示，與對照組相比，MRSP在10μM～100μM范圍內可成劑量和時間依賴性的抑制VSMCs的增殖。流式細胞儀細胞周期檢測結果表明，不同濃度的MRSP（10μM、25μM、50μM）較

12、對照組均能使VSMCs生長停滯于G0/G1期，G0/G1期的細胞比例分別為（24.90±3.46）％、（36.85±3.57）％和（62.45±2.83）％；流式細胞儀Annexin V-FITC細胞凋亡檢測結果表明，與對照組相比，隨著時間的延長（24h、48h、72h），25μM MRSP可有效誘導VSMCs的凋亡，作用72h時的細胞凋亡率為（30.4±2.1）％；細胞凋亡ELISA結果表明，隨著時間的延長，25μM MRSP與對照組

13、相比有顯著的促VSMCs凋亡作用；Western blot檢測結果顯示，與對照組相比，MRSP可成濃度依賴性（10μM、25μM、50μM）的抑制p-Raf-1、p-ERK1/2和p-Akt的表達水平。
　　 4.結論
　　 根據(jù)Mfn2的最小功能序列人工合成的MRSP具有顯著抑制VSMCs增殖的作用，使細胞周期停滯于G0/G1期，這一作用主要是使Ras-Raf-ERK1/2通路受到抑制，p-Raf-1和p-ERK1/2