牛源抗菌肽BMAP27、BMAP28單基因和串聯(lián)基因重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及應(yīng)用研究.pdf

1、抗菌肽是一類廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)的非特異性免疫應(yīng)答產(chǎn)物，是近年來新型抗菌藥物開發(fā)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。牛源Cathelicidins抗菌肽家族具有廣譜抗微生物活性，BMAP27和BMAP28是Cathelicidins家族中具有代表性的兩個(gè)成員，但兩者的抗菌譜并不完全重疊。本論文以牛源抗菌肽BMAP27和BMAP28為研究對(duì)象，旨在構(gòu)建攜帶有BMAP27、BMAP28和BMAP27-BMAP28串聯(lián)基因的重組表達(dá)質(zhì)粒，以期為開發(fā)治療奶牛乳腺炎

2、的基因藥物提供技術(shù)支持。
　　試驗(yàn)一、BMAP27和BMAP28重組原核質(zhì)粒的構(gòu)建。從奶牛中性粒細(xì)胞中提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄出cDNA，分別擴(kuò)增BMAP27、BMAP28的OFR全長(zhǎng)基因片段，并重組至原核表達(dá)載體pET-28a(+)中，構(gòu)建pET-28a(+)-BMAP27、pET-28a(+)-BMAP28重組原核表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)行PCR、酶切鑒定和DNA測(cè)序。
　　結(jié)果:PCR和酶切鑒定均獲得了與預(yù)期長(zhǎng)度相符的基因片段，且測(cè)

3、序結(jié)果正確。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建了pET-28a(+)-BMAP27、pET-28a(+)-BMAP28重組表達(dá)質(zhì)粒。
　　試驗(yàn)二、BMAP27-BMAP28串聯(lián)基因重組原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。以pET-28a(+)-BMAP27、pET-28a(+)-BMAP28重組質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)合成特異性引物，擴(kuò)增獲取BMAP27和BMAP28基因片段，并在BMAP27基因3'端引入轉(zhuǎn)角蛋白編碼序列。將BMAP27基因片段重組至原核表達(dá)載

4、體pET-28a(+)中，構(gòu)建N-pET-28a(+)-BMAP27重組質(zhì)粒，再將BMAP28基因片段重組至N-pET-28a(+)-BMAP27，獲取攜帶有BMAP27-轉(zhuǎn)角蛋白編碼序列-BMAP28的串聯(lián)基因重組表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)行PCR、酶切和DNA測(cè)序鑒定。結(jié)果:PCR和酶切鑒定均獲得了與預(yù)期長(zhǎng)度相符的片段，且測(cè)序結(jié)果正確。結(jié)論:成功構(gòu)建了pET-28a(+)-BMAP27-BMAP28重組原核表達(dá)質(zhì)粒。
　　試驗(yàn)三、BMAP

5、27、BMAP28單基因和BMAP27-BMAP28串聯(lián)基因重組真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。分別以pET-28a(+)-BMAP27、pET-28a(+)-BMAP28和pET-28a(+)-BMAP27-BMAP28重組質(zhì)粒為模板，獲取BMAP27、BMAP28單基因和BMAP27-BMAP28串聯(lián)基因片段，并重組至真核表達(dá)載體pEGFP-C3中，構(gòu)建pEGFP-C3-BMAP27、pEGFP-C3-BMAP28和pEGFP-C3-BMAP2

6、7-BMAP28真核重組質(zhì)粒，并進(jìn)行PCR、酶切和DNA測(cè)序鑒定。結(jié)果:PCR和酶切鑒定均獲得了與預(yù)期長(zhǎng)度相符的片段，且測(cè)序結(jié)果正確。結(jié)論:成功構(gòu)建了pEGFP-C3-BMAP27-BMAP28、pEGFP-C3-BMAP27、pEGFP-C3-BMAP28重組真核表達(dá)質(zhì)粒。
　　試驗(yàn)四、重組真核質(zhì)粒的細(xì)胞轉(zhuǎn)染。采用脂質(zhì)法分別將pEGFP-C3-BMAP27、pEGFP-C3-BMAP28和pEGFP-C3-BMAP27-BMAP