日本囊對蝦CathepsinB基因在卵巢發(fā)育中的表達研究.pdf

1、日本囊對蝦（Marsupenaeus japonicus）是我國東南沿海重要的經(jīng)濟養(yǎng)殖種類。對蝦的性腺發(fā)育一直是研究的熱點。本實驗室已克隆出組織蛋白酶 B（Cathepsin B）的cDNA全長，并發(fā)現(xiàn)該基因在卵巢中特異性表達。我們采用實時定量PCR（RT-PCR）、免疫組織化學(xué)、Western blot、原位雜交等技術(shù)研究了Cathepsin B在日本囊對蝦卵巢中不同發(fā)育階段的表達分析。
　　首先采用HE染色，并結(jié)合性腺發(fā)育指數(shù)

2、（gonad-somatic index，GSI）確定日本囊對蝦卵巢發(fā)育各個期的卵細胞的形態(tài)和染色特征，將其劃分為四個期，分別為卵黃合成前期（previtellogenic oocyte stage），內(nèi)源性卵黃合成期（endogenous vitellogenic oocyte stage），外源性卵黃合成期（ exogenous vitellogenic oocyte stage）和成熟期（mature oocyte stage）。

3、
　　采用實時定量PCR技術(shù)，以18S rRNA為內(nèi)標基因，檢測日本囊對蝦Cathepsin B基因在mRNA水平不同卵巢發(fā)育時期的表達。結(jié)果顯示，Cathepsin B在卵黃合成前期表達最高，內(nèi)源性卵黃合成期和外源性卵黃合成期表達水平基本一致，而在成熟期表達水平急劇下降。其中卵黃合成前期與其它三期相比具有顯著性差異（p<0.05），內(nèi)源性卵黃合成期和外源性卵黃合成期Cathepsin B不具有顯著性差異（p>0.05），而成熟期

4、與前邊三期相比具有顯著性差異（p<0.05）。
　　而Western blot結(jié)果顯示Cathepsin B蛋白在卵黃合成前期表達量最低，這與實時定量結(jié)果不一致，推測 Cathepsin B的控制機制是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制。Western blot實驗顯示Cathepsin B蛋白的分子大小要比其理論值要大，推測Cathepsin B是一個翻譯后調(diào)控蛋白。實時熒光定量PCR實驗和Western blot都顯示Cathepsin B的 m

5、RNA和蛋白表達在成熟期下調(diào)，這表明Cathepsin B在卵細胞成熟期的作用可能減弱。
　　原位雜交和免疫組化實驗顯示Cathepsin B的 mRNA和蛋白質(zhì)都在卵細胞的細胞質(zhì)表達，而且免疫組化顯示 Cathepsin B蛋白首先出現(xiàn)在離卵細胞的細胞核最近位置。但在成熟期的皮質(zhì)棒中沒有檢測到Cathepsin B的mRNA或蛋白的存在。
　　以上實驗結(jié)果顯示Cathepsin B在日本囊對蝦卵巢發(fā)育過程中可能發(fā)揮了重要作