SHH轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對心梗后血管再生的影響.pdf

1、本實驗利用BMMSC作為載體細(xì)胞接受SHH基因轉(zhuǎn)染，期待其移植到體內(nèi)后能夠在保持較良好的生物學(xué)特性基礎(chǔ)上有效表達被轉(zhuǎn)染基因，以達到增強治療的目的;我們用電穿孔法將SHH基因轉(zhuǎn)入大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（以下簡寫B(tài)MMSCSHH），然后將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞植入大鼠心梗周圍區(qū);SHH通過調(diào)節(jié)促血管生長因子促進血管新生，為說明BMMSCSHH能在細(xì)胞治療的基礎(chǔ)上促進治療性血管生長，我們首先從分子生物學(xué)水平檢測移植部位SHH信號傳導(dǎo)通路、及其調(diào)節(jié)的VEGF

2、、Ang-1等促血管新生因子的變化。最后，通過進行血管密度分析來驗證梗死區(qū)與正常心肌組織之交界區(qū)的血管新生情況。本課題分為三個部分。
　　 第一部分:利用Amaxa的Nucleofector核轉(zhuǎn)染儀將SHH外源性基因轉(zhuǎn)染入大鼠BMMSC，檢測BMMSCSHH中目的蛋白表達、轉(zhuǎn)染對細(xì)胞的損害等驗證轉(zhuǎn)染方式的可行性。第二部分:分別于移植后第1、2、4、8周取標(biāo)本，通過qPCR檢測移植后移植部位SHH下游基因、以及促血管再生因子的表達

3、差異。第三部分:血管密度分析法分析各組間心梗與正常心肌組織之交界區(qū)血管密度差異。
　　 第一部分SHH轉(zhuǎn)染BMMSC細(xì)胞
　　 目的:探討SHH基因轉(zhuǎn)染BMMSC可行性。
　　 方法:1.通過電轉(zhuǎn)法將SHH基因轉(zhuǎn)染入BMMSC細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率;2.分別繪制未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長曲線;3.PCR，RT-PCR、western-blot檢測BMMSCSHH中SHH基因的表達。
　　 結(jié)果:轉(zhuǎn)染后4

4、8小時，經(jīng)熒光倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率約為30％，PCR檢測BMMSCSHH中SHH表達較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞明顯升高，實時定量PCR檢測其升高約7倍左右，通過western-blot檢測轉(zhuǎn)染后SHH蛋白產(chǎn)表達明顯升高。轉(zhuǎn)染后BMMSC生長曲線指數(shù)生長期及平臺期延后，但轉(zhuǎn)染后第12天能夠重合。
　　 結(jié)論:本實驗?zāi)軌蛴行⑼庠葱許HH基因轉(zhuǎn)染入BMMSC并能獲得有效蛋白表達，能夠滿足實驗要求。
　　 第二部分BMMSCSHH對移植部

5、位SHH下游通路的調(diào)節(jié)
　　 目的:探討B(tài)MMSCSHH移植后對下游信號通路的影響。
　　 方法:以冠脈結(jié)扎法制作近交系Wistar大鼠急性心肌梗死模型，160只急性心肌缺血模型動物隨機分為4組（每組40只）。轉(zhuǎn)基因組（Transfection group）在建立急性心梗模型后即在梗死周邊部位移植BMMSCSHH，細(xì)胞組(BMMSC group, B)在對等梗死周邊部位移植等量的BMMSC，混合組(Mixed group

6、, M)在對等梗死周邊部位注射等量BMMSC和pcDNA3.1-Shh DNA的混合物，對照組(Controlgroup, C)在對等梗死周邊部位注射等容積的低糖DMEM液。分別于移植后第1、2、4、8周取標(biāo)本行1.qPCR檢測移植后各組間移植部位Ptc1、Gli-2、COUP-TFⅡ等SHH信號傳導(dǎo)通路下游基因表達情況。2.qPCR檢測移植后各組間移植部位VEGF、 Ang-1促血管再生因子的表達情況。
　　 結(jié)果:移植后第七

7、天，轉(zhuǎn)染組移植部位SHH下游基因Ptc1、Gli-2、COUP-TFⅡ表達分別較對照組、細(xì)胞組、混合組上調(diào)(Ptc1:P＜0.01,P＜0.05,P＜0.05; COUP-TFⅡ:P＜0.01,P＜0.05,P＜0.05; Gli-2:P＜0.01, P＜0.01,P＜0.01);轉(zhuǎn)染組VEGF、 Ang-1等促血管再生因子也分別較對照組、細(xì)胞組、混合組表達上調(diào)(VEGF:P＜0.01,P＜0.05,P＜0.05; Ang-1:P＜0.

8、01,P＜0.05,P＜0.05)。但后續(xù)第2、4、8周檢測上訴因子表達已無明顯差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:本實驗BMMSCSHH一定時間內(nèi)上調(diào)移植部位SHH信號傳導(dǎo)路徑及促血管再生因子，為后續(xù)檢測心梗后移植部位BMMSCshh血管再生情況提供了依據(jù)。
　　 第三部分BMMSCSHH對移植部位血管再生的影響
　　 目的:檢測BMMSCSHH對移植部位血管再生的影響。
　　 方法:通過免疫組化染色標(biāo)

9、記血管內(nèi)皮細(xì)胞CD34抗原，顯示心梗與正常心肌組織交界區(qū)血管，HE染色也能夠顯示各級血管。免疫組化染色和HE染色相互補充，通過血管密度分析法分析各組間交界區(qū)血管密度差異。
　　 結(jié)果:CD34免疫組化染色后行血管密度分析轉(zhuǎn)染組交界區(qū)血管密度分別較對照組、細(xì)胞組、混合組上調(diào)(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01); HE染色后行血管密度分析轉(zhuǎn)染組交界區(qū)血管密度分別較對照組、細(xì)胞組、混合組上調(diào)(P＜0.01，P＜0.01，P＜0