血管緊張素Ⅱ?qū)Υ笫笱芡饽こ衫w維細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化物酶的調(diào)節(jié)及相關(guān)分子機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的：血管壁由內(nèi)膜、中膜和外膜構(gòu)成。近年來的研究發(fā)現(xiàn)血管外膜可產(chǎn)生大量的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，通過自分泌、旁分泌作用參與多種心血管疾病發(fā)生的病理生理過程。正常情況下，血管壁產(chǎn)生的ROS被內(nèi)源性抗氧化物酶清除，若其大量產(chǎn)生或者清除受到抑制，可導(dǎo)致氧化/抗氧化失衡，氧化應(yīng)激發(fā)生，血管壁結(jié)構(gòu)和功能受損。本研究在體外細(xì)胞水平觀察三種主要的內(nèi)源性抗氧化物酶在血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，

2、AngⅡ)刺激的血管外膜成纖維細(xì)胞(Vascularadventitial fibroblasts，VAF)中的表達(dá)及其相關(guān)信號通路，并進(jìn)一步探討轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisomeproliferator-activated receptorγ，PPARγ)在上述過程中的調(diào)節(jié)作用及相關(guān)機(jī)制。
　　 方法：取Sprague-Dawley(SD)大鼠胸主動脈外膜進(jìn)行體外培養(yǎng)VAF，待細(xì)胞長至亞融合狀態(tài)給予相應(yīng)

3、的藥物刺激，然后采用實(shí)時定量PCR技術(shù)和蛋白免疫印記Western blot檢測VAF內(nèi)源性抗氧化物酶包括錳超氧化物歧化酶(Manganese-superoxide dismutase，Mn-SOD)、銅/鋅超氧化物歧化酶(Copper/zinc-superoxide dismutase，Cu/Zn-SOD)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GPx)的mRNA和蛋

4、白表達(dá)，并用相應(yīng)的試劑盒檢測其中發(fā)生改變的抗氧化物酶的活性水平；采用實(shí)時定量PCR和Western blot測定轉(zhuǎn)錄因子PPARγ的mRNA和蛋白水平；Western blot檢測細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化因子α-平滑肌肌動蛋白(α-Smooth muscle actin，α-SMA)、AngⅡ1型受體(AngiotensinⅡtype1 receptor，AT1R)的蛋白表達(dá)以及ERK1/2的磷酸化水平；采用電泳遷移率變動分析(Electophor

5、etic Mobility Shift Assay，EMSA)方法測定PPARγ的DNA結(jié)合活性；流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平。
　　 結(jié)果：(1)AngⅡ可抑制VAF內(nèi)CAT的mRNA、蛋白表達(dá)和活性水平，呈劑量和時間依賴性，對Mn-SOD、Cu/Zn-SOD和GPx無明顯影響。(2)外源性的CAT(Polyethylene glycol-catalase，PEG-CAT)可明顯降低AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS生成及VAF

6、表型轉(zhuǎn)化因子α-SMA的表達(dá)。(3)AT1R抑制劑Losartan預(yù)處理和AT1R小干擾RNA(Small-interferingRNA，siRNA)轉(zhuǎn)染明顯抑制AngⅡ誘導(dǎo)的CAT表達(dá)降低。ERK1/2通路抑制劑PD98059同樣可逆轉(zhuǎn)AngⅡ?qū)AT的抑制作用，而PI3K抑制劑LY294002對AngⅡ誘導(dǎo)的CAT下調(diào)無明顯抑制作用。(4)AngⅡ可呈劑量和時間依賴性抑制VAF內(nèi)PPARγ的mRNA和蛋白表達(dá)，并降低PPARγ的DN

7、A結(jié)合活性。PPARγ siRNA轉(zhuǎn)染后顯著降低了細(xì)胞內(nèi)CAT的mRNA和蛋白表達(dá)。PPARγ激動劑15d-PGJ2和吡格列酮可在轉(zhuǎn)錄水平抑制AngⅡ誘導(dǎo)的CAT表達(dá)降低，這一抑制作用被PPARγ拮抗劑GW9662所逆轉(zhuǎn)。(5)Losartan預(yù)處理以及AT1R siRNA轉(zhuǎn)染對15d-PGJ2和吡格列酮抑制AngⅡ誘導(dǎo)的CAT下調(diào)作用無明顯影響，而ERK1/2抑制劑PD98059可顯著增強(qiáng)15d-PGJ2和吡格列酮對AngⅡ誘導(dǎo)的CA

8、T表達(dá)降低的逆轉(zhuǎn)作用。
　　 結(jié)論：AngⅡ可通過AT1R激活ERK1/2信號通路，進(jìn)而抑制大鼠VAF內(nèi)抗氧化物酶CAT的表達(dá)和活性，使細(xì)胞內(nèi)ROS清除減少，大量聚積，導(dǎo)致VAF表型轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞。轉(zhuǎn)錄因子PPARγ介導(dǎo)了AngⅡ?qū)AT的抑制作用。PPARγ激動劑15d-PGJ2和吡格列酮可在轉(zhuǎn)錄水平逆轉(zhuǎn)AngⅡ誘導(dǎo)的CAT表達(dá)降低，從而保護(hù)VAF免于氧化應(yīng)激損傷和發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，其保護(hù)機(jī)制可能與抑制ERK1/2磷酸化水平有