PDE5-siRNA和iNOS基因修飾的脂肪干細胞在勃起功能障礙治療中的體外研究.pdf

1、目的：通過比較研究PDE5-siRNA和iNOS單雙基因在大鼠ADSCs中的表達效應,探討PDE5-siRNA和iNOS基因修飾ADSCs應用于ED治療的可行性和有效性。
　　方法：采用Ⅰ型膠原酶消化法原代培養(yǎng)SD大鼠ADSCs,并通過流式細胞術(shù)檢測間充質(zhì)干細胞相關(guān)免疫表型和定向多向誘導分化鑒定ADSCs。取第4代ADSCs,分別采用10μmol/L氯甲基苯甲酰氨(CM-Dil)熒光活性染料和50μmol/L5-乙炔基-2’-脫氧

2、尿嘧啶核苷(EdU)進行標記,分別于標記后第7天、14天、21天和28天通過流式細胞術(shù)和熒光顯微鏡比較研究CM-Dil和EdU對ADSCs的體外標記示蹤效果。分別構(gòu)建攜帶大鼠PDE5-siRNA的重組慢病毒載體(LV-PDE5-siRNA-GFP)和iNOS基因的重組腺病毒載體(Ad-iNOS-EGFP),并通過LV-PDE5-siRNA-GFP(MOI=70)和Ad-iNOS-EGFP(MOI=30)共轉(zhuǎn)染第4代ADSCs,同時設立空

3、白對照組(未轉(zhuǎn)染組)、陰性對照組一(LV-NC-siRNA-GFP轉(zhuǎn)染組)、陰性對照組二(Ad-NC-EGFP轉(zhuǎn)染組)、陰性對照組三(LV-NC-siRNA-GFP+Ad-NC-EGFP共轉(zhuǎn)染組)、陽性對照組一(LV-PDE5-siRNA-GFP轉(zhuǎn)染組)、陽性對照組二(Ad-iNOS-EGFP轉(zhuǎn)染組)。于共轉(zhuǎn)染后3d、5d、7d、10d和14d,分別采用實時熒光定量PCR和WesternBlot技術(shù)檢測PDE5基因和iNOS基因在mRN

4、A水平和蛋白水平的表達情況。同時,分別采用硝酸還原酶法和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定ADSCs中NO和cGMP濃度水平。
　　結(jié)果：培養(yǎng)的細胞陽性表達間充質(zhì)干細胞免疫表型CD49d、CD73、CD90、CD105和CD106而CD31、CD34和CD45為陰性表達,且成脂肪誘導分化細胞油紅O染色陽性、成平滑肌誘導分化細胞共表達α-SMA和Desmin蛋白、成血管內(nèi)皮誘導分化細胞vWF表達為陽性、成神經(jīng)誘導分化細胞Nestin和

5、NeuN表達陽性,而對照組均為陰性。實驗組(LV-PDE5-siRNA-GFP+Ad-iNOS-EGFP共轉(zhuǎn)染組)PDE5基因在mRNA水平和蛋白水平于共轉(zhuǎn)染后3d明顯下調(diào),5~7dPDE5-siRNA干擾效率達到峰值,10d后開始降低,但第14天干擾效率仍維持較高水平,與陽性對照組一(LV-PDE5-siRNA-GFP轉(zhuǎn)染組)間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);同時,腺病毒介導的iNOS基因于共轉(zhuǎn)染24h后在mRNA水平和蛋白水平均顯

6、著上調(diào),并于轉(zhuǎn)染后5~7d達到峰值,10d后開始降低,14天后仍維持較高表達水平,其表達水平與陽性對照組二(Ad-iNOS-EGFP轉(zhuǎn)染組)間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。共轉(zhuǎn)染后3d、5d、7d、10d和14d,實驗組(LV-PDE5-siRNA-GFP+Ad-iNOS-EGFP共轉(zhuǎn)染組)和陽性對照組二(Ad-iNOS-EGFP轉(zhuǎn)染組)NO濃度于轉(zhuǎn)染后3d開始增加,5~7d達到峰值,于第10天出現(xiàn)降低后再呈增加趨勢,至第14天仍維

7、持較高濃度水平,且兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);實驗組(LV-PDE5-siRNA-GFP+Ad-iNOS-EGFP共轉(zhuǎn)染組)、陽性對照組一(LV-PDE5-siRNA-GFP轉(zhuǎn)染組)和陽性對照組二(Ad-iNOS-EGFP轉(zhuǎn)染組)cGMP濃度亦于轉(zhuǎn)染后3d顯著增加,5~7d達到峰值,于第10天后出現(xiàn)降低后再呈增加趨勢,至第14天仍維持較高濃度水平,而實驗組cGMP濃度顯著高于兩陽性對照組(P<0.01),但兩陽性對照組間差異