hTRX-PR39融合基因重組腺伴病毒載體的構(gòu)建及對(duì)缺氧雞胚的促血管生成作用.pdf

1、背景：
　　 目前，腦血管病的發(fā)病率和病死率不斷升高，尤其成為了威脅人類身體健康的突出問(wèn)題和醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。新的治療藥物和物理治療方法的臨床應(yīng)用，不斷地改善著急診的搶救成功率和延長(zhǎng)了病人的生命，但是依然不能從根本上逆轉(zhuǎn)病人病理生理變化，受損的腦機(jī)能難以恢復(fù)。本課題根據(jù)近年來(lái)腦血管病后組織修復(fù)的細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)研究進(jìn)展，設(shè)計(jì)了HRE(低氧反應(yīng)元件)調(diào)控的分泌表達(dá)“血管生成的總開關(guān)”-PR39與人硫氧還蛋白hTRX融合表達(dá)的重

2、組腺相關(guān)病毒，通過(guò)介入方式轉(zhuǎn)導(dǎo)有腦供血不足和具有梗塞性腦血管病傾向的腦組織和血管。目的是希望在腦缺氧和梗塞發(fā)生早期能起動(dòng)PR39的分泌表達(dá)，通過(guò)它特異的抑制泛素-蛋白酶體對(duì)HIF-1α的降解，來(lái)增加血管形成的細(xì)胞因子和受體(VEGFA、KDR、FLT-1和FGF-1)長(zhǎng)期持續(xù)性高表達(dá)，實(shí)現(xiàn)腦缺氧和梗塞發(fā)生后的早期神經(jīng)元修復(fù)和血管再建，也通過(guò)PR39具有的抗炎癥反應(yīng)、抗缺血缺氧應(yīng)激凋亡作用，人硫氧還蛋白的抗氧化、抗細(xì)胞凋亡、保護(hù)缺血再灌注

3、損傷及神經(jīng)因子樣作用等，保護(hù)受損害神經(jīng)細(xì)胞的存活和功能。它將為缺血性腦血管病的預(yù)防和治療尋找新的理論和方法。
　　 目的：
　　 為了探討PR39對(duì)腦缺血的保護(hù)作用，本研究構(gòu)建腺相關(guān)病毒(AAV)介導(dǎo)的融和基因hTRX-PR39，驗(yàn)證其在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ECV304細(xì)胞株)表達(dá)；在缺氧ECV304細(xì)胞內(nèi)提高VEGF-A，VEGFR-1，VEGFR-2，F(xiàn)GFR-1，Syndecan-4表達(dá)水平及抗缺氧應(yīng)激凋亡作用及其對(duì)

4、缺氧環(huán)境雞胚的促血管生成作用。
　　 方法：
　　 1.設(shè)計(jì)合成PR39的正向和反向引物，使用互為引物模板PCR方法，擴(kuò)增獲得兩端具有BamHI和Ecor721酶切位點(diǎn)的PR39cDNA片段。將該片段克隆到pGEM-Teasy中，轉(zhuǎn)化細(xì)菌篩選陽(yáng)性克隆，酶切鑒定，序列測(cè)定分析。
　　 2.以已有hTRX片段為模板，設(shè)計(jì)合成hTRX的正向和反向引物，PCR擴(kuò)增獲得具有Eco721和EcoI酶切位點(diǎn)的hTRX cDNA

5、片段。并將其克隆到pGEM-T easy中，轉(zhuǎn)化細(xì)菌篩選陽(yáng)性克隆，酶切鑒定，序列測(cè)定分析。
　　 3.BamHI和EcoR721雙酶切pGEM-T-hTRX和pGEM-T-PR39，將獲取的PR39/BamHI，EcoRI721片段克隆到pGEM-T-hTRX/BamHI，EcoRI721載體中，構(gòu)建了pGEM-T-hTRX-PR39載體。
　　 4.酶切上述載體獲取hTRX-PR39融合基因，將其插入具有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的

6、pSSCMV病毒載體質(zhì)粒中，得到重組腺相關(guān)病毒載體質(zhì)粒。
　　 5.將已構(gòu)建的重組腺相關(guān)病毒載體質(zhì)粒、腺病毒輔助質(zhì)粒PFG140和包裝質(zhì)粒pAAV/Ad三質(zhì)粒磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染293細(xì)胞系，通過(guò)同源重組獲得hTRX-PR39重組腺相關(guān)病毒載體，收集病毒，斑點(diǎn)雜交(Dot blot)法測(cè)定病毒滴度。
　　 6.AAV-hTRX-PR39和空病毒載體(EV)分別感染ECV304，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)hTRX表達(dá)情況，以此驗(yàn)證融合

7、基因在的ECV304表達(dá)。
　　 7.將ECV304分為AAV-hTRX-PR39組和PBS組，在1％、5％O2條件下培養(yǎng)，應(yīng)用臺(tái)盼藍(lán)染色法進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，觀察hTRX-PR39對(duì)缺氧細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　 8.流式細(xì)胞儀檢測(cè)(FCM)分析低氧環(huán)境下ECV304細(xì)胞凋亡情況。
　　 9.應(yīng)用定量PCR檢測(cè)儀檢測(cè)ECV304中VEGF-A，VEGFR-1，VEGFR-2，F(xiàn)GFR-1，Syndecan-4及PR39

8、的表達(dá)水平。
　　 10.120只雞胚隨機(jī)分為AAV-hTRX-PR39組和PBS組，將各組細(xì)胞分別在低氧(1％O2、5％O2)和常氧(20％O2)條件培養(yǎng)，圖象軟件Image Pro Plus(IPP)分析雞胚尿膜囊(CAM)血管密度。
　　 結(jié)果：
　　 1.經(jīng)DNA測(cè)序證實(shí)，PCR獲得了編碼具有Eco721和EcoI酶切位點(diǎn)的hTRX cDNA片段和編碼BamHI和EcoR721酶切位點(diǎn)的PR39cDNA片

9、段。分析證實(shí)核酸序列和推導(dǎo)的氨基酸同數(shù)據(jù)庫(kù)資料一致。
　　 2.hTRX-PP39融合基因經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確，測(cè)序結(jié)果與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的序列完全一致。
　　 3.重組質(zhì)粒pGEM-T-hTRX-PR39酶切圖譜證實(shí)我們已經(jīng)將hTRX-PR39融合肽cDNA克隆到pGEM-T表達(dá)載體中。
　　 4.成功構(gòu)建了重組腺相關(guān)病毒質(zhì)粒pSSCMV/hTRX-PR39。包裝、回收病毒后，Dot blot法測(cè)定重組病毒滴度為3

10、.46×1012～3.46×1013PFU/ml。
　　 5.免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)到重組hTRX-PR39的AAV載體能在ECV304中進(jìn)行表達(dá)。
　　 6.定量PCR檢測(cè)到重組AAV-hTRX-PR39可提高缺氧ECV304中VEGF-A，VEGFR-1，VEGFR-2，F(xiàn)GFR-1，Syndecan-4及PR39的表達(dá)水平，明顯高于PBS組(P＜0.001)。
　　 7.流式細(xì)胞儀分析低氧環(huán)境下ECV304細(xì)胞周

11、期圖，實(shí)驗(yàn)組ECV304中凋亡率明顯小于PBS組。
　　 8.低氧環(huán)境下，實(shí)驗(yàn)組的雞胚尿膜囊血管密度明顯大于PBS組。在常氧環(huán)境下，血管密度并無(wú)明顯差別。
　　 結(jié)論：
　　 1.應(yīng)用PCR成功克隆出具有EcoR721和EcoRI酶切位點(diǎn)的hTRX cDNA片段。
　　 2.應(yīng)用PCR成功克隆出具有BaEH I和EcoR721酶切位點(diǎn)的PR39cDNA片段。
　　 3.成功構(gòu)建了pGEM-T-hT