多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑AL3810實(shí)驗(yàn)治療甲狀腺癌及機(jī)制研究.pdf

1、甲狀腺癌（Thyroid Cancer，TC）是內(nèi)分泌腺系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，目前其治療主要以手術(shù)治療、手術(shù)后放射性碘（Radioactive Iodine，RAI）治療以及促甲狀腺激素（Thyroid Stimulating Hormone，TSH）釋放抑制治療為主。盡管在過去的幾十年研究表明，惡性甲狀腺癌的治療有新突破，已經(jīng)有新的有效的藥物和制劑出現(xiàn)，目前大部分晚期甲狀腺癌病人對常規(guī)的放射性碘131的治療并不敏感，且可供選擇的治療

2、有限。因此，積極尋找有效的、新的治療藥物和治療策略對提高甲狀腺癌的療效、改善患者的生存率及提高他們的生活質(zhì)量具有重大意義。
　　本課題通過體內(nèi)外不同模型系統(tǒng)評價(jià)了小分子多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑AL3810對甲狀腺癌的實(shí)驗(yàn)治療效果。結(jié)果顯示，該化合物能顯著抑制多種甲狀腺癌細(xì)胞的體內(nèi)外增殖。AL3810作用72或120小時(shí)后，可以劑量依賴性的抑制甲狀腺癌細(xì)胞TT、TPC-1和SW579的增殖，IC50值分別為2.56?M、7.03?M和

3、590 nM。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中AL3810對細(xì)胞株來源的人源甲狀腺癌SW579、TT等裸小鼠皮下移植瘤也均具有顯著的抑制作用。SW579模型中，AL3810以5 mg/kg連續(xù)口服給藥三周抑制率可達(dá)97.57％左右，與索拉菲尼60 mg/kg實(shí)驗(yàn)治療效果相當(dāng)。更令人欣喜的是，在該模型中連續(xù)實(shí)驗(yàn)治療三周后，停藥兩周該組腫瘤仍未有明顯生長。我們還嘗試模擬腫瘤后期給藥，即當(dāng)腫瘤生長至2000 mm3左右開始實(shí)驗(yàn)治療，AL3810在此方案下依然能發(fā)

4、揮很好的抑制腫瘤生長的效果。AL381010 mg/kg實(shí)驗(yàn)治療組給藥后小鼠所荷腫瘤明顯縮小，五周時(shí)該組腫瘤平均體積已縮至300 mm3左右。同樣，在另一個(gè)甲狀腺癌TT模型中，AL381010 mg/kg也能顯著抑制TT裸小鼠皮下移植瘤的生長，給藥處理28天后抑制百分?jǐn)?shù)為66.15%，抑制作用優(yōu)于Sorafenib60 mg/kg和XL18430 mg/kg。
　　我們前期的研究結(jié)果表明AL3810是一個(gè)新生血管抑制劑，因此在以上

5、甲狀腺腫瘤的實(shí)驗(yàn)治療中，我們以內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)記物CD34為檢測指標(biāo)，免疫組化（Immunohistochemistry，IHC）考察其對腫瘤內(nèi)新生血管生成的影響。結(jié)果顯示AL3810能夠顯著降低瘤組織內(nèi)微小血管的數(shù)目：當(dāng)SW579裸小鼠移植瘤組織內(nèi)AL3810給藥劑量為5 mg/kg和10 mg/kg時(shí)，瘤組織CD34表達(dá)量分別下降了81.88%和92.83%；TT模型中結(jié)果類似，AL3810給藥劑量為0.4、2和10 mg/kg時(shí)，瘤

6、組織內(nèi)CD34表達(dá)量分別下降了59.06%、63.78%和81.10%。這些結(jié)果顯示該化合物的抗甲狀腺腫瘤活性與其抗血管新生能力密切相關(guān)。流式細(xì)胞儀的檢測結(jié)果展示，AL3810可濃度依賴和時(shí)間依賴地阻滯甲狀腺癌細(xì)胞于G1期，并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，最終導(dǎo)致甲狀腺癌細(xì)胞死亡。0.5?M AL3810作用48小時(shí)即可誘導(dǎo)約20%的SW579細(xì)胞發(fā)生凋亡。我們進(jìn)一步檢測裸小鼠甲狀腺癌皮下移植瘤在AL3810作用后的情況。免疫組化染色凋亡標(biāo)記物TU

7、NEL結(jié)果顯示，無論是TT模型還是SW579模型中，AL3810作用后，瘤組織中TUNEL染色陽性率具有顯著升高。在SW579模型中，當(dāng)AL3810劑量為0.4、2和10 mg/kg時(shí)，凋亡率分別為4.66%、22.00%和36.00%；TT模型中，凋亡率則分別為6.66%、13.66%和22.66%。再次證實(shí) AL3810確實(shí)可引起甲狀腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。同樣該化合物還可引起細(xì)胞周期阻滯的發(fā)生，AL38101?M作用24小時(shí)，64.2%

8、的SW579細(xì)胞被阻滯處于G1期。相應(yīng)的Western Blot結(jié)果則表明，在AL3810處理后，與G1期阻滯相關(guān)的周期調(diào)控蛋白如p21和p27的表達(dá)量顯著上升，而蛋白CyclinD1、CDK2和P-Rb的表達(dá)量則顯著下調(diào)，這與流式周期的結(jié)果一致。
　　AL3810的前期研究結(jié)果提示，該化合物在分子水平可抑制RET磷酸化的發(fā)生。鑒于RET在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用，我們進(jìn)一步考察該化合物是否通過抑制RET信號通路而抑制RET依

9、賴的人甲狀腺癌細(xì)胞的體內(nèi)外生長。我們首先選用轉(zhuǎn)染RET的BaF3工具細(xì)胞考察。結(jié)果表明，AL3810能顯著抑制轉(zhuǎn)染RET的BaF3的體外增殖，可阻滯細(xì)胞于G1期，并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，但對親本細(xì)胞BaF3的生長則無明顯影響。Western Blot結(jié)果證實(shí)，該化合物能顯著抑制BaF3-RET以及人源甲狀腺癌細(xì)胞TT和TPC-1細(xì)胞內(nèi)RET磷酸化的發(fā)生，同時(shí)下調(diào)其下游蛋白AKT、ERK1/2以及STAT3的磷酸化。以上結(jié)果表明，該化合物在分