柴胡皂苷-b對(duì)肝細(xì)胞癌血管生成及VEGF-ERK-HIF-1α信號(hào)通路的影響.pdf

1、目的：研究柴胡皂苷（ saikosaponins， SS）-b對(duì)肝細(xì)胞癌（ hepatocellular carcinoma，HCC）的治療作用，并探討其對(duì)腫瘤血管生成的影響及相關(guān)分子機(jī)制。
　　方法：⑴取50只雄性BALB/c小鼠，建立肝癌 H22移植瘤模型，隨機(jī)分為對(duì)照組（Control，NS）、SS-b低、中、高劑量組（5、10、20 mg·kg-1·d-1）、阿霉素（Doxorubicin，DOX，2 mg·kg-1，隔日

2、給藥）組。各組小鼠采用腹腔注射給藥，連續(xù)給藥10 d。剝離瘤體，稱重，計(jì)算抑瘤率；白細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)，胸腺及脾臟指數(shù)；HE染色觀察腫瘤組織的形態(tài)學(xué)改變；免疫組織化學(xué)法檢測(cè) CD34的表達(dá)情況以反應(yīng)腫瘤組織的微血管密度；Western Blot檢測(cè)腫瘤組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2, MMP-2）

3、、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（ MMP-9）、缺氧誘導(dǎo)因子（Hypoxia-inducible factor1α, HIF-1α）蛋白的表達(dá)變化及細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases, ERK）的磷酸化表達(dá)變化。⑵采用MTT法觀察不同濃度的SS-b對(duì)人肝癌細(xì)胞株 HepG-2細(xì)胞增殖的影響；利用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室模型觀察SS-b對(duì)HepG-2細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響；采

4、用 Western Blot檢測(cè) HepG-2細(xì)胞中 VEGF、MMP-2、MMP-9、HIF-1α和ERK的磷酸化表達(dá)水平。⑶建立雞胚尿囊膜模型（CAM），光鏡下觀察 SS-b低、中、高各劑量組對(duì)CAM血管生成的影響，在 BI-2000圖像分析系統(tǒng)下對(duì)血管分叉數(shù)、血管內(nèi)徑的進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)，并分析結(jié)果。⑷采用MTT法觀察 SS-b對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）增殖的影響；通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)研究SS-b對(duì)HUVEC細(xì)胞遷移及伸展能力的影響。

5、r>　　結(jié)果：①SS-b具有明顯的抑瘤作用，SS-b低、中、高劑量（5、10、20 mg·kg-1·d-1）和 DOX（2 mg·kg-1，隔日給藥）的抑瘤率分別為24.8％、31.2%、48.6%、和59.6%，其抑瘤作用具有一定的劑量依賴性。②HE染色結(jié)果顯示對(duì)照組小鼠腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，呈多極核分裂和有絲分裂。SS-b和DOX不同劑量組小鼠腫瘤組織可見(jiàn)較大的壞死面積和較多的空泡區(qū)域，壞死區(qū)呈粉紅色染色，細(xì)胞核溶解。③CD34的免疫組

6、化結(jié)果顯示對(duì)照組腫瘤組織微血管豐富，SS-b低、中、高劑量組和DOX可以顯著降低腫瘤組織的微血管數(shù)目。④與對(duì)照組比較， SS-b低、中、高劑量組和 DOX組小鼠腫瘤組織中VEGF、MMP-2、HIF-1α的表達(dá)和ERK的磷酸化程度顯著降低。⑤MTT結(jié)果顯示不同濃度的SS-b對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG-2細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用。經(jīng)不同濃度SS-b作用后，HepG-2細(xì)胞增殖抑制率分別為17.7%、36.7%、44.7%、58.3%、75.1

7、%、97.3%，具有一定的劑量依賴性。⑥劃痕實(shí)驗(yàn)和 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，低、中、高劑量的SS-b對(duì) HepG-2細(xì)胞的侵襲和遷移具有不同程度的抑制作用；SS-b低、中、高劑量和DOX可以顯著降低 HepG-2細(xì)胞 VEGF、MMP-2、MMP-9、HIF-1α的表達(dá)和ERK的磷酸化程度。⑦與對(duì)照組相比，b-FGF誘導(dǎo)的CAM血管分支數(shù)及血管內(nèi)徑均有明顯增加；與 b-FGF組相比，SS-b低、中、高各組均能抑制b

8、-FGF誘導(dǎo)的CAM血管生成，其抑制率分別為：48.1%、57.8%、63.0%。⑧MTT結(jié)果顯示，當(dāng)藥物SS-b濃度為0.1 mg/mL時(shí)HUVEC細(xì)胞的增殖抑制率為12%，與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；劃痕實(shí)驗(yàn)表明，SS-b對(duì)HUVEC的遷移能力有一定的抑制作用，表現(xiàn)為劃痕直徑明顯寬于對(duì)照組。
　　結(jié)論：SS-b可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲和腫瘤血管生成，該作用與其下調(diào)VEGF、MMP-2、MMP-9及HIF-1α有關(guān)。