四甲基吡嗪對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠模型的治療作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景：肺動(dòng)脈高壓(pulmonary hypertension，PH)是以肺動(dòng)脈壓力進(jìn)行性升高，繼而引起右心室肥大、右心功能衰竭，并最終導(dǎo)致患者死亡的一大類疾病。其肺血管的基本病理變化，早期以肺動(dòng)脈痙攣收縮為主，后期出現(xiàn)以肺動(dòng)脈內(nèi)膜、中膜（平滑肌層）和外膜增厚為主要表現(xiàn)的血管重塑。近年來的研究表明，肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary areterial smooth muscle cells，PASMCs)內(nèi)鈣離子濃度（[Ca2+]i

2、）、鉀離子濃度（[K+]i）升高（包括其各自通道的變化）在肺動(dòng)脈平滑肌（pulmonary arterial smooth muscle，PASM）收縮和重塑過程中，起了至關(guān)重要的作用。升高的[Ca2+]i可與鈣調(diào)蛋白（calcium modulin，CaM）結(jié)合，形成 Ca2+-CaM復(fù)合物，該復(fù)合物進(jìn)一步結(jié)合并激活胞質(zhì)內(nèi)的肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase，MLCK），活化的MLCK使粗肌絲原肌球蛋

3、白橫橋的肌球蛋白輕鏈（myosinlight chain，MLC）磷酸化（P-MLC），P-MLC進(jìn)而激活橫橋 ATP酶，分解 ATP提供能量引發(fā)肌絲滑動(dòng)，平滑肌收縮。細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中升高的[Ca2+]i還可激活一些鈣依賴激酶（如鈣調(diào)蛋白激酶，CaMK）及其他轉(zhuǎn)錄因子[如c-Fos，激活的T細(xì)胞的核因子(nuclear factor of activated T-cells, NFAT), cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(response e

4、lement binding protein, CREB)]等，促使休眠細(xì)胞進(jìn)入增殖周期，促進(jìn)PASMCs增殖。細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器（如肌質(zhì)網(wǎng)）釋放鈣和細(xì)胞外液鈣通過細(xì)胞膜上的各種鈣通道進(jìn)入細(xì)胞，是細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i增高的兩個(gè)途徑，其中后者起主要作用。細(xì)胞膜上的鈣通道主要有電壓依賴性鈣通道（voltage dependent calcium channels， VDCCs）、受體操縱性鈣通道（receptoroperatedcalcium c

5、hannels，ROCCs）、鈣池操縱性鈣通道（store operatedcalcium channels，SOCCs）和鈉鈣交換體（Na+/Ca2+exchangers，NCX）等。目前對(duì)ROCCs結(jié)構(gòu)與功能的研究尚不充分， NCX功能改變常繼發(fā)于VDCCs和SOCCs的變化（具體見本文最后討論）。目前研究較為一致的觀點(diǎn)是，在肺動(dòng)脈高壓過程中，VDCCs及 SOCCs活性和/或數(shù)量增加，導(dǎo)致細(xì)胞外鈣離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)增多，胞內(nèi)[Ca2+

6、]i增加，誘發(fā)遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞持續(xù)收縮和增殖，是促進(jìn)肺動(dòng)脈高壓發(fā)生的重要機(jī)制之一。細(xì)胞膜電壓依賴性 K+通道（Kv）功能降低或表達(dá)減少，在促進(jìn)肺動(dòng)脈收縮和增殖方面也發(fā)揮著重要作用。鉀通道功能降低或表達(dá)減少一方面可使細(xì)胞靜息膜電位（Em）上升，激活VDCCs，促進(jìn)細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流，升高[Ca2+]i，引起PASM收縮和增殖；另一方面，鉀外流減少可使動(dòng)脈平滑肌[K+]i增高，高[K+]i抑制細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性，后者促

7、凋亡作用降低，增殖/凋亡平衡被打破，也促進(jìn)肺動(dòng)脈重塑和肺動(dòng)脈高壓進(jìn)展。因此，從理論上推測(cè)，細(xì)胞膜上的鈣通道和鉀通道，都可能成為肺動(dòng)脈高壓治療藥物的作用靶點(diǎn)。只要能夠抑制細(xì)胞膜上的鈣離子通道數(shù)量表達(dá)（或活性）和/或提高鉀離子通道數(shù)量（或功能），即可降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，延緩甚至逆轉(zhuǎn)肺動(dòng)脈高壓進(jìn)展。目前治療PH的靶向藥物僅有4類，但專利產(chǎn)權(quán)全部掌握在發(fā)達(dá)國(guó)家?guī)讉€(gè)為數(shù)不多制藥企業(yè)，藥品價(jià)格極為昂貴，因此尋找和開發(fā)我國(guó)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)、適合我國(guó)

8、患者消費(fèi)能力的PH治療藥物非常必要。四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TMP），又名川芎嗪（ligustrazine），是從我國(guó)傳統(tǒng)中藥川芎(ligusticum chuanxiong)中提取的活性成分之一，上世紀(jì)80年代曾被證明具有一定的鈣離子拮抗作用，近年被用來治療肺源性心臟病，取得了令人滿意的效果，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。本文擬就 TMP治療肺動(dòng)脈高壓的具體作用及機(jī)制展開研究。
　　目的：探索TMP治療低

9、氧及野百合堿誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓大鼠模型的有效劑量和安全性；體內(nèi)及體外環(huán)境下，分別探討其對(duì)PASMCs[Ca2+]i和經(jīng)典瞬時(shí)受體電位蛋白（canonicaltransient receptor potential protein，TRPC）、Kv的影響；體外環(huán)境下，TMP對(duì)PASMCs增殖、遷移和毒性作用，揭示TMP治療PH的分子機(jī)制，為將來肺動(dòng)脈高壓藥物的開發(fā)提供參考。
　　方法：⑴SPF級(jí)雄性 SD大鼠，體重（235-271）g(

10、不同批次)，隨機(jī)分為常氧（normoxia，N）、N+TMP100mg/kg?d、缺氧(hypoxia，H)、H+TMP50mg/kg?d、H+TMP100mg/kg?d、H+TMP200mg/kg?d，每組5只，組間體重?zé)o差異。N組常氧（21％O2）、H組低氧（11±0.5%O2）干預(yù)21天后，分別測(cè)量各組大鼠右心室壓力（RVP）、右心室肥厚指數(shù)[RV/(LV+S)]、肺、肝、腎組織HE染色、血液學(xué)檢查肝功能、腎功能，確定 TMP體內(nèi)

11、有效安全劑量，此后不同批次大鼠模型均按此有效、安全劑量給藥。⑵顯微分離N、N+TMP、H和H+TMP組d-PAs，其中部分血管平滑肌經(jīng)膠原酶法消化、離心分離得到PASMCs，三氣培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-48h，細(xì)胞貼壁后， InCyte細(xì)胞內(nèi)鈣濃度檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)細(xì)胞內(nèi)基礎(chǔ)鈣濃度及錳淬滅。后者可間接評(píng)價(jià)鈣池操縱性鈣內(nèi)流(store operated calcium entry，SOCE）大小。另一部分d-PA提取RNA或蛋白后通過熒光定量PCR和免疫

12、印跡法分別檢測(cè)經(jīng)典瞬時(shí)受體電位通道蛋白（canonicaltransient receptor potentialprotein，TRPC）1和TRPC6 mRNA及蛋白表達(dá)變化；熒光定量PCR法檢測(cè)Kv1.5和Kv2.1mRNA表達(dá)變化。⑶顯微分離正常大鼠d-PAs，膠原酶消化分離血管平滑肌，培養(yǎng)PASMCs，通過MTT法確定不同濃度TMP對(duì)PASMCs增殖影響，聯(lián)合測(cè)定培養(yǎng)基乳酸脫氫酶（LDH）確定體外 TMP的安全有效用藥濃度；T

13、ranswell法測(cè)定 TMP對(duì)PASMCs遷移的影響。⑷顯微分離正常大鼠遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈（distal pulmonary arteries，d-PAs）平滑肌，膠原酶消化分離血管平滑肌，常氧及缺氧條件下培養(yǎng)PASMCs，TMP暴露或不暴露60h后，InCyte細(xì)胞內(nèi)鈣濃度檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)細(xì)胞內(nèi)基礎(chǔ)鈣濃度及錳淬滅。提取細(xì)胞 RNA或蛋白后通過熒光定量 PCR和免疫印跡法分別檢測(cè) TRPC1和TRPC6 mRNA及蛋白表達(dá)變化；熒光定量PCR法檢測(cè)

14、Kv1.5和Kv2.1mRNA表達(dá)變化。⑸野百合堿（monocrotaline，MCT）誘導(dǎo)大鼠 PH模型，予 TMP治療，通過右心室壓力、右心肥厚指數(shù)、肺部病理等評(píng)價(jià)其療效；提取肺動(dòng)脈平滑肌RNA或蛋白后通過熒光定量 PCR和免疫印跡法分別檢測(cè) TRPC1和TRPC6 mRNA及蛋白表達(dá)變化；熒光定量PCR法檢測(cè)Kv1.5和Kv2.1mRNA表達(dá)變化。
　　結(jié)果：①成功建立慢性低氧性肺動(dòng)脈高壓（chronic hypoxic p

15、ulmonaryhyperten-sion, CHPH）大鼠模型。低氧21天后，大鼠mRVP升高、d-PAs壁明顯增厚、RV/(LV+S)增大、心肌細(xì)胞肥大。②TMP對(duì)CHPH大鼠模型有治療作用；低于200mg/kg?d的劑量對(duì)常氧和低氧大鼠是安全的；100mg/kg?d和200mg/kg?d對(duì)低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠的治療效果相同。③成功體外培養(yǎng)原代PASMCs，細(xì)胞具有典型肺動(dòng)脈平滑肌形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能，完全滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要。④CHPH大鼠

16、模型PASMCs[Ca2+]i和SOCE增加，而TMP可顯著抑制這種變化。與此一致的是，CHPH大鼠模型d-PAs的Kv1.5、Kv2.1表達(dá)明顯降低， TRPC1、TRPC6表達(dá)升高，而TMP可顯著逆轉(zhuǎn)這種變化。⑤低氧培養(yǎng)的PASMCs增殖、遷移增加，TMP干預(yù)后，其增殖率、遷移率降低；干預(yù)濃度下，未檢測(cè)到TMP的細(xì)胞毒性。⑥低氧培養(yǎng)正常大鼠PASMCs可使[Ca2+]i和SOCE增加，TMP可抑制二者的增加。低氧培養(yǎng)的PASMCs

17、Kv1.5、Kv2.1表達(dá)降低，TRPC1、TRPC6表達(dá)增高，TMP可升高Kv、降低TRPC的表達(dá)。⑦TMP對(duì)MCT誘導(dǎo)的PH大鼠模型同樣具有治療作用，對(duì)Kv1.5、Kv2.1和TRPC1、TRPC6的影響同低氧模型。
　　結(jié)論：⑴TMP可安全、有效改善CHPH大鼠模型d-PAs重塑，降低右心室壓，降低右心室肥厚指數(shù)。⑵治療濃度TMP對(duì)PASMCs產(chǎn)生明顯抑制增殖和遷移的作用，且這種作用不依賴與其毒性作用。⑶體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)低氧