碳青霉烯類藥物聯(lián)合舒巴坦或頭孢哌酮對銅綠假單胞菌的藥敏對比研究.pdf

1、目的：
　　 探討碳青霉烯類藥物聯(lián)合應用舒巴坦或頭孢哌酮等對銅綠假單胞菌(PA)的抗菌作用。
　　 方法：
　　 1.K-B法測定藥敏及聯(lián)合藥敏120株臨床株P(guān)A，來于山東大學齊魯醫(yī)院細菌室、山東中醫(yī)藥大學第二附院細菌室，均為致病菌株。K-B法測定藥敏及聯(lián)合藥敏。根據(jù)抑菌環(huán)形態(tài)分為協(xié)同、相加、無關(guān)、拮抗。按藥敏分為敏感菌株、多耐藥菌株(Multipledrugresistant，MDR)、泛耐藥菌株(Pandru

2、gresistant，PDR)、廣耐藥菌株(ExtensiveDrugResistantXDR)。舒巴坦(Sulbactam，SUB)藥敏紙片為自行制作，含量125μg。以協(xié)同+相加記為協(xié)同率。
　　 2.聯(lián)合MIC測定:
　　 2.1抗菌藥物原液配制選取48株P(guān)A進行下一步的聯(lián)合MIC測定，分別為敏感菌株、MDR、XDR、PDR各12株。用pH7.2滅菌磷酸鹽緩沖液將藥物分別稀釋為:比阿培南、亞胺培南、磷霉素、頭孢哌酮

3、、舒巴坦5120μg/mL;阿米卡星1280μg/mL;環(huán)丙沙星2560μg/mL。
　　 2.2單藥孔板制備分別取上述各種抗菌藥物原液10μL加入90μLMH肉湯中，然后做倍比稀釋（取50μL放入第2孔中，依次類推）。共稀釋16孔使得各濃度為:比阿培南、亞胺培南、磷霉素、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢哌酮、舒巴坦512、256～0.016μg/mL;阿米卡星128～0.004μg/mL;環(huán)丙沙星256～0.008μg/mL。
　

4、　 2.3單藥MIC測定將待檢菌分別配置0.5麥氏單位菌懸液，用MH肉湯中稀釋200倍（菌懸液中細菌的濃度大約為5.0×105cfu/mL）后取50μL加入各個孔中（此時各個藥物的終點濃度應為放入MH肉湯菌液前濃度的1/2），混勻，37度放置18～24h，取出，測定待檢菌的每種藥物單獨MIC。同時做陰性、陽性對照以及標準菌株質(zhì)控。
　　 2.4聯(lián)合用藥孔板制備根據(jù)每種藥物的MIC設計棋盤方陣的各孔濃度，共8×8孔，藥物濃度范圍

5、是MIC的23倍到1/24倍。加藥時，橫排為A藥物，從左到右，濃度從高到低，豎排為B藥物，從上到下濃度從高到低，使得各孔中藥物濃度不一樣，初始放入濃度應為最終濃度的4倍。然后每孔加入配好的藥物A藥和藥物B各25μL。
　　 2.5聯(lián)合用藥MIC測定在上述各孔中分別加入配好的含有待檢菌的MH肉湯50μL，混勻孵育18-24小時取出讀取各抗菌藥物對應的MIC數(shù)值，同時做陰性對照、陽性對照標準菌株質(zhì)控。
　　 2.6聯(lián)合用藥分

6、級抑菌濃度（Fractionalinhibitoryconcentration，F(xiàn)IC）指數(shù)按下列公式計算:FIC指數(shù)=A藥聯(lián)合的MIC/A藥單用的MIC+B藥聯(lián)合的MIC/B藥單用的MIC。結(jié)果解釋:FIC指數(shù)≤0.5為協(xié)同作用;0.5＜FIC指數(shù)＜4為無關(guān)作用;FIC指數(shù)≥4為拮抗作用。由于舒巴坦對銅綠假單胞菌天然耐藥，在計算FIC時不計舒巴坦。
　　 3.聯(lián)合殺菌曲線選用敏感菌株、MDR、XDR、PDR各2株，測定亞胺培南

7、、比阿培南分別聯(lián)合舒巴坦、頭孢哌酮、阿米卡星的殺菌益線。因舒巴坦對銅綠假單胞菌不敏感，測定濃度均為亞胺培南、比阿培南的相同濃度。結(jié)合我們預試驗結(jié)果，僅做0、8小時菌落計數(shù)。
　　 根據(jù)聯(lián)合用藥組菌落計數(shù)，較最有效的單藥組減少≥2.0log10CFU/mL時，可定義為協(xié)同，減少≤1.0log10CFU/mL時為無關(guān)作用，聯(lián)合后增加≥2.0log10CFU/mL時定義為拮抗。
　　 結(jié)果：
　　 1.K-B法單藥藥敏

8、120株P(guān)A中，敏感菌株數(shù)分別為:阿米卡星86、磷霉素63、環(huán)丙沙星61、頭孢他定66、頭孢哌酮64、頭孢哌酮/舒巴坦65、氨曲南67、哌拉西林/他唑巴坦64、亞胺培南83、比阿培南82、美羅陪南85、多粘菌素104。根據(jù)藥敏，敏感菌56株，MDR36株，XDR13株，PDR15株。
　　 2.K-B法聯(lián)合藥敏與比阿培南聯(lián)合最有效的依次為磷霉素（82株）、舒巴坦(51株)、阿米卡星（41株）、頭孢哌酮/舒巴坦（36株）;與亞胺培

9、南最有效的為磷霉素（82株）、舒巴坦(48株)、阿米卡星(44株);但亞胺培南與頭孢哌酮/舒巴坦(44株)、頭孢哌酮（68株）出現(xiàn)拮抗。碳青霉烯聯(lián)合舒巴坦對不同敏感性PA的的協(xié)同率無差異。
　　 3.聯(lián)合MIC測定聯(lián)合MIC法與K-B法結(jié)果基本一致。與亞胺培南、比阿培南聯(lián)合最有效的依次均為磷霉素(27株、42株)、阿米卡星（33株、31株）、舒巴坦（21株、22株）;但亞胺培南與頭孢哌酮（24株）或頭孢哌酮/舒巴坦（6株）出現(xiàn)拮

10、抗。結(jié)合與舒巴坦的結(jié)果分析，亞胺培南主要與頭孢哌酮產(chǎn)生拮抗。
　　 4.聯(lián)合殺菌曲線比阿培南:聯(lián)合舒巴坦協(xié)同8株，聯(lián)合阿米卡星協(xié)同8株，聯(lián)合頭孢哌酮/舒巴坦協(xié)同4株，無關(guān)4株;聯(lián)合頭孢哌酮協(xié)同4株，無關(guān)4株。亞胺培南:聯(lián)合舒巴坦協(xié)同8株，聯(lián)合阿米卡星協(xié)同4株，無關(guān)4株，聯(lián)合頭孢哌酮/舒巴坦拮抗4株，無關(guān)4株，聯(lián)合頭孢哌酮拮抗4株，無關(guān)4株。
　　 結(jié)論：
　　 1.與比阿培南聯(lián)合最有效的依次為磷霉素、舒巴坦、阿米

11、卡星、頭孢哌酮/舒巴坦;
　　 2.與亞胺培南最有效的為磷霉素、舒巴坦、阿米卡星;
　　 3.體外聯(lián)合藥敏發(fā)現(xiàn)，碳青霉烯類藥物聯(lián)合舒巴坦或磷霉素對于銅綠假單胞菌感染協(xié)同率最高，但亞胺培南與頭孢哌酮聯(lián)合有拮抗作用。
　　 第二部分
　　 地塞米松上調(diào)煙曲霉孢子侵襲力和A549細胞纖連蛋白表達
　　 目的：
　　 在體外環(huán)境中，比較煙曲霉孢子對受不同濃度地塞米松作用的A549細胞的侵襲力;探討

12、地塞米松對孢子侵襲力和A549細胞纖連蛋白表達量的影響。
　　 方法：
　　 (1)煙曲霉孢子侵襲力測定:分別用纖連蛋白抗體，不同濃度地塞米松預處理A549細胞后，將煙曲霉孢子侵襲A549細胞，4h后計數(shù)黏附在細胞表面和進入細胞的孢子總數(shù)，并將其占總孢子數(shù)的比率計為侵襲力。
　　 (2)應用實時熒光定量PCR技術(shù)(RT-PCR)檢測上述各地塞米松濃度預處理A549細胞24h后，細胞纖連蛋白基因轉(zhuǎn)錄表達水平;應用w

13、estern-blot和免疫組化技術(shù)檢測不同濃度地塞米松預處理48h后，細胞纖連蛋白的表達量。
　　 結(jié)果：
　　 (1)纖連蛋白抗體室溫下封閉處理細胞1h后，孢子對A549細胞的侵襲力較對照組下降24.8％,不同濃度地塞米松預處理A549細胞4h后，各組煙曲霉孢子的侵襲力無統(tǒng)計學差異，P＞0.05。而預處理24h后，25mg/L地塞米松組孢子侵襲力(24.66％±2.41％)高于對照組(19.17％±2.53％)組和1

14、mg/L(19.93％±3.06％)組，5mg/L(22.47％±2.46％)高于對照組，p＜0.05。25mg/L地塞米松預處理24h合并纖連蛋白抗體封閉1h后，孢子侵襲率無明顯下降。
　　 (2)RT-PCR細胞纖連蛋白基因轉(zhuǎn)錄相對表達量:25mg/L組細胞纖連蛋白基因轉(zhuǎn)錄相對表達量（9.19×103±1.2×10-3）高于對照組(4.61×10-3±1.54×10-3)和1mg/L組(6.20×10-3±1.93×10-3