西洛他唑?qū)χ嗵钦T導(dǎo)的人THP-1單核細(xì)胞分泌Il-6影響及機(jī)制探討.pdf

1、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary atherosclerotic heart disease)指冠狀動脈粥樣硬化使血管官腔狹窄或阻塞，或（和）因冠脈功能性改變（痙攣）導(dǎo)致心肌缺血缺氧或壞死而引起的心臟病，簡稱冠心病(coronary heart disease，CHD)。冠心病是嚴(yán)重危害人類生命健康的常見病，進(jìn)入二十一世紀(jì)以來，隨著老年人口比例增加，人口老年化，并且高鹽高脂飲食、肥胖人口的增多及生活節(jié)奏的緊張使冠心病患者日趨“

2、年青化”，至此冠心病的患病率和病死率呈現(xiàn)明顯上升趨勢。有關(guān)冠心病發(fā)病機(jī)制的研究一直是全世界關(guān)注的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，但其機(jī)制仍尚不明確，成為冠心病防治進(jìn)展的主要難點(diǎn)。動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是冠心病發(fā)病的主要病理基礎(chǔ)。研究表明，動脈粥樣硬化是由多種因素作用于不同環(huán)節(jié)所致，而這些因素稱為危險因素，主要的危險因素如高齡、血脂升高、吸煙、血壓升高、血糖升高、高半胱氨酸血癥以及高尿酸血癥等。這些危險因素在一定程度上促進(jìn)了動脈

3、粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展。以往和近年來提出關(guān)于動脈粥樣硬化發(fā)病學(xué)說，如脂質(zhì)浸潤學(xué)說、內(nèi)皮損傷反應(yīng)學(xué)說、血栓形成學(xué)說、平滑肌細(xì)胞單克隆學(xué)說、同型半胱氨酸學(xué)說、精氨酸學(xué)說、內(nèi)皮功能紊亂學(xué)說、氧化應(yīng)激學(xué)說等均不足以完全解釋AS性疾病的發(fā)病基礎(chǔ)。然而，近年大量研究證實(shí)，炎癥反應(yīng)已被公認(rèn)為動脈粥樣硬化形成的機(jī)制:動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，同其它炎癥一樣，AS也具有炎癥的基本病理特征:變性、滲出和增生。隨著研究的進(jìn)一步深入，發(fā)現(xiàn)AS不僅是血管局部

4、炎癥病變，還是多種免疫細(xì)胞異常導(dǎo)致的全身免疫紊亂。在動脈粥樣硬化病變發(fā)生發(fā)展過程中，從開始的脂質(zhì)條紋到纖維斑塊和粥樣斑塊甚至不穩(wěn)定斑塊的生成、破裂和血栓形成，各種炎癥細(xì)胞和多種炎癥介質(zhì)參與其中.冠狀動脈局部或全身的炎癥反應(yīng)在動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展過程及其所致的并發(fā)癥中起著重要作用。研究證實(shí)，動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定的主要因素可能與炎癥反應(yīng)的激活有關(guān)。
　　 單核-巨噬細(xì)胞(mononuclear macrophage)是重要的免

5、疫細(xì)胞，是動脈粥樣硬化形成過程中最常見的炎癥細(xì)胞，是AS斑塊重要組成部分，同時也是易損斑塊形成的重要病理生理學(xué)基礎(chǔ)。正常情況下，血管內(nèi)皮細(xì)胞能阻止白細(xì)胞聚集并可以促進(jìn)纖維蛋白的溶解。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞受到高脂血癥、高血壓、糖尿病、吸煙、肥胖以及炎癥等刺激因素時，會導(dǎo)致初始的血管炎癥損傷并產(chǎn)生的炎癥細(xì)胞因子可吸引單核細(xì)胞到達(dá)損傷局部并進(jìn)入動脈內(nèi)膜下間隙，即成熟為巨噬細(xì)胞，并吞噬血管內(nèi)膜的脂蛋白形成泡沫細(xì)胞，粥樣斑塊初步成形。單核—巨噬細(xì)胞將外源性

6、抗原遞呈給T淋巴細(xì)胞，激活獲得性免疫系統(tǒng)，加重血管炎性病變。同時巨噬細(xì)胞還分泌組織因子和金屬蛋白酶，使動脈內(nèi)膜的細(xì)胞外基質(zhì)溶解，從而導(dǎo)致斑塊纖維帽的消化和斑塊破裂。As斑塊中的單核-巨噬細(xì)胞分泌多種炎性細(xì)胞因子，如IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）和TNF-α，進(jìn)一步加劇單核細(xì)胞聚集、巨噬細(xì)胞的增殖以及平滑肌細(xì)胞的遷移、增殖，促使As斑塊不斷進(jìn)展。另外更有證據(jù)表明在急性冠狀動脈綜合癥(ACS)中炎癥反應(yīng)不僅局限于病灶部位甚至越過

7、血管床擴(kuò)散，并伴有IL-6、CRP等炎癥標(biāo)志物水平的增高和全身循環(huán)中白細(xì)胞激活。研究表明，動脈粥樣硬化斑塊中的單核細(xì)胞受刺激后可分泌的IL-6是炎癥反應(yīng)的一個中樞性調(diào)節(jié)因子，在冠心病的血管損傷和急性心肌缺血中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。
　　 脂多糖(LPs)，也稱作細(xì)菌內(nèi)毒素，是構(gòu)成革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞外壁的主要成分。脂多糖可以從活菌體上緩慢釋放，當(dāng)菌體破碎后大量釋放到周圍環(huán)境中。脂多糖是一種兩親的分子，包括一個疏水性的磷脂部分（磷脂A），

8、構(gòu)成細(xì)菌外膜最外面的部分，其親水部分為多糖部分，伸出到菌體的外面。脂多糖分子上的脂類部分和多糖部分都參與脂多糖的生物活性。不同細(xì)菌的完整脂多糖可以特異性地結(jié)合在人單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面.脂多糖引起的炎癥反應(yīng)是由其與宿主細(xì)胞的相互作用所引起的，機(jī)體對脂多糖的敏感性是由可溶性的以及細(xì)胞表面的結(jié)合蛋白質(zhì)介導(dǎo)和調(diào)節(jié)的。LPS介導(dǎo)的炎癥過程研究發(fā)現(xiàn)其主要是誘導(dǎo)致炎癥因子如白介素、單細(xì)胞趨化蛋白、氧自由基等大量表達(dá)，以致促進(jìn)炎癥和抵抗炎癥系統(tǒng)之間失

9、衡，從而產(chǎn)生炎癥。
　　 白介素細(xì)胞-6（interleukin6，IL-6）又稱前炎癥細(xì)胞因子，可通過體液和細(xì)胞免疫功能影響炎癥、組織損傷和宿主防御。IL-6是一種多功能的細(xì)胞因子，產(chǎn)生于血管內(nèi)皮細(xì)胞、活化T淋巴細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等。目前認(rèn)為IL-6可能通過多種途徑參與冠脈粥樣硬化(AS)的形成與進(jìn)展，例如IL-6促進(jìn)巨噬細(xì)胞表面LDL受體的合成及其對LDL的攝取，促進(jìn)粥樣斑塊形成;IL-6可刺激巨噬細(xì)

10、胞分泌單核細(xì)胞趨化蛋白，促使單核細(xì)胞聚集進(jìn)入血管內(nèi)皮下參與斑塊形成;IL-6以自分泌方式刺激血管平滑肌細(xì)胞增生;IL-6可誘導(dǎo)肝細(xì)胞產(chǎn)生血漿纖溶酶原激活物抑制物(PAI)以及肝臟產(chǎn)生急性期反應(yīng)蛋白，促進(jìn)冠狀動脈血栓形成。研究發(fā)現(xiàn)，IL-6可刺激斑塊中平滑肌細(xì)胞的增殖從而導(dǎo)致斑塊破裂。IL-6是AS及其他心血管疾病重要的預(yù)測因子，IL-6水平的高低與疾病的預(yù)后及心血管事件的再發(fā)生緊密相關(guān)。從AS患者冠狀動脈提取的旋磨斑塊中發(fā)現(xiàn)，IL-6表

11、達(dá)明顯增加，提示IL-6與不穩(wěn)定斑塊密切相關(guān)，可知血漿IL-6值的升高對患者ACS的發(fā)生有預(yù)測價值。Rus HG等研究發(fā)現(xiàn)，60％不穩(wěn)定心絞痛患者中血循環(huán)IL-6增高，而穩(wěn)定性心絞痛患者卻無明顯變化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)升高的IL-6水平預(yù)示不穩(wěn)定性斑塊的存在，也預(yù)示發(fā)生心肌梗死的危險性增高。
　　 西洛他唑(cilostazol)是一種新型抗血小板藥物，屬于磷酸二酯酶抑制劑，可逆、選擇性抑制磷酸二酯酶活性和阻斷cAMP降解，同時抑制

12、腺苷的攝取，能抑制血小板聚集及血管擴(kuò)張。西洛他唑具有預(yù)防動脈粥樣硬化、抗動脈血栓形成和進(jìn)行性血管狹窄的功能，可廣泛用于糖尿病并發(fā)癥的治療，還可以調(diào)節(jié)血脂及擴(kuò)張動脈血管，起到穩(wěn)定斑塊作用，在缺血性腦卒中的二級預(yù)防中有明確抗血小扳聚集作用，且還有改善血管內(nèi)皮功能及降低出血風(fēng)險。近年來研究發(fā)現(xiàn)，支架植入術(shù)(PCI)后應(yīng)用西洛他唑可減少新生內(nèi)膜增生和重構(gòu)，有抗晚期再狹窄作用，但西洛他唑抗As發(fā)生發(fā)展及可能的作用機(jī)制目前尚不清楚.Lee等研究發(fā)現(xiàn)

13、，西洛他唑能減小低密度脂蛋白(LDL)受體缺陷小鼠動脈粥樣硬化的面積而且減少TNF-a的合成，同時減少斑塊局部巨噬細(xì)胞的聚集，MCP-1下降。體外試驗(yàn)表明，西洛他唑抑制THP-1單核細(xì)胞內(nèi)MCP-1和MMP-9的mRNA表達(dá)，這些機(jī)制可能與減少炎癥有關(guān)。另一項(xiàng)研究也表明，西洛他唑能抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞IL-1β、IL-6及TNF-a的合成，這種作用是通過抑制NF-KB活性所致，從而起到抗粥樣硬化作用，在冠心病治療中起重要作用。

14、>　　 單核-巨噬細(xì)胞是是動脈粥樣硬化形成過程中最常見的炎癥細(xì)胞，同時也是易損斑塊形成的重要病理生理學(xué)基礎(chǔ)，不但在動脈粥樣硬化起始和進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，還在斑塊破裂和血栓形成中也扮演著重要角色。動脈粥樣硬化斑塊中的單核細(xì)胞受刺激后可分泌的IL-6是炎癥反應(yīng)的一個中樞性調(diào)節(jié)因子，在冠心病的血管損傷和急性心肌缺血中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。西洛他唑是一種新型抗血小板藥物，不僅具有抗血小板聚集，還能促進(jìn)動脈擴(kuò)張，抑制平滑肌細(xì)胞增殖和內(nèi)膜增厚。西洛他唑

15、在預(yù)防和治療冠心病中起著重要作用，但西洛他唑抗動脈粥硬化樣的作用機(jī)制尚不明確。西洛他唑是否對LPS誘導(dǎo)的人THP-1單核細(xì)胞分泌IL-6有影響，其中作用機(jī)制又是如何。
　　 本課題分為兩個部分，將體外培養(yǎng)人THP-1單核細(xì)胞作為研究對象，實(shí)驗(yàn)分為對照組、LPS組、西洛他唑低溶度組、西洛他唑中溶度組以及西洛他唑高濃度組，西洛他唑組加入不同溶度(10、20、40μmol/L)干預(yù)12h加入LPS刺激24h。(1)應(yīng)用ELISA法檢測

16、各組細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-6水平，觀察IL-6水平的變化，探討西洛他唑?qū)χ嗵钦T導(dǎo)的人THP-1單核細(xì)胞分泌IL-6影響。(2)應(yīng)用Western blot檢測各組細(xì)胞漿IκBα及細(xì)胞核NF-κB P65的表達(dá)，觀察IκBα及細(xì)胞核NF-κBP65的表達(dá)的變化，探討西洛他唑?qū)χ嗵钦T導(dǎo)的人THP-1單核細(xì)胞分泌IL-6的機(jī)制。旨在為臨床冠心病治療合理用藥提供基礎(chǔ)研究依據(jù)。結(jié)果分述如下:
　　 1.西洛他唑能抑制LPS誘導(dǎo)的人THP-

17、1單核細(xì)胞白介素6的合成
　　 1.1西洛他唑不同濃度干預(yù)人THP-1單核細(xì)胞
　　 以人THP-1單核細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象，實(shí)驗(yàn)分為五組，空白對照組，LPS組，西洛他唑低濃度組（LPS100μg/L+西洛他唑10μmol/L），西洛他唑中濃度組（LPS100μg/L+西洛他唑20μmol/L），西洛他唑高濃度組（LPS100μg/L+西洛他唑40μmol/L），實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度西洛他唑干預(yù)12h，再給予終濃度為100μg/

18、L的LPS作用24h。
　　 1.2 CCK-8檢測藥物對細(xì)胞的增殖活性影響
　　 西洛他唑預(yù)干預(yù)12小時，再加入LPS聯(lián)合作用24小時后，與對照組相比較，西洛他唑10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L加LPS100μg/L聯(lián)合作用對細(xì)胞生存率無顯著影響(P＞0.05)，而西洛他唑80μmol/LL加LPS100μg/L聯(lián)合作用對細(xì)胞有顯著影響(P＜0.05)。
　　 1.3酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELI

19、SA)，檢測IL-6水平
　　 不同濃度西洛他唑均能抑制LPS100μg/L誘導(dǎo)人THP-1單核細(xì)胞合成白介素6，隨著劑量的增加，這種抑制作用越加明顯，當(dāng)西洛他唑劑量達(dá)40μmol/L，抑制作用最大，與LPS組相比差異均有顯著性(P＜0.05)。
　　 2.西洛他唑?qū)χ嗵钦T導(dǎo)的人THP-1單核細(xì)胞漿蛋白IκBα及核蛋白NF-κB P65水平影響
　　 2.1 Western blot檢測細(xì)胞漿蛋白IκBα及細(xì)胞

20、核蛋白NF-κB P65表達(dá)對照組人單核細(xì)胞漿蛋白IκBα水平最高，而核蛋白NF-κB P65水平最低，LPS組人單核細(xì)胞漿蛋白IκBα最低，而核蛋白NF-κB P65水平最高(P＜0.05)。加入西洛他唑預(yù)干預(yù)12h，西洛他唑可抑制LPS所致的人TPH-1單核細(xì)胞漿蛋白Iκ Bα水平的下降及核蛋白NF-κB P65水平的增加，隨濃度增加，這種抑制作用越強(qiáng)，差異有顯著性(P＜0.05)。
　　 通過上述兩個部分的實(shí)驗(yàn)，我們能夠得