利用真核表達體系驗證茶樹UGT84A22和C4H基因的功能.pdf

1、多酚類物質(zhì)是茶樹次生代謝的特征成分，同時也是茶葉有益人體健康的重要組成成分，影響著茶葉色澤、香氣、滋味等感官品質(zhì)的形成。茶樹的多酚類物質(zhì)及其衍生物種類復雜多樣，其生物合成主要途徑涉及莽草酸途徑，苯丙烷代謝途徑和類黃酮合成途徑，同時還涉及一些衍生化途徑，如甲基化、?；?、糖苷化和羥基化等。本文重點研究酚類物質(zhì)糖苷化和羥基化的相關(guān)基因及其功能，能夠為深入了解茶樹多酚類物質(zhì)代謝調(diào)控提供基礎，對于開展茶樹新品種選育工作和研究茶葉品質(zhì)形成機理具有

2、一定的指導意義。
　　本文利用生物信息學手段對茶樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的UGTs基因進行篩選、分類和基序分析；利用真核表達體系對本實驗室已克隆全長的 CsUGT84A22基因進行功能驗證。利用RACE技術(shù)和基因組步移技術(shù)分別克隆CsC4H基因全長及其啟動子序列，并利用真核表達體系驗證CsC4H基因功能；利用qRT-PCR技術(shù)分析CsC4H基因在不同發(fā)育組織和器官的表達特異性；利用根癌農(nóng)桿菌介導的煙草瞬時表達技術(shù)和激光共聚焦顯微鏡觀察和分

3、析CsC4H帶GFP標簽融合蛋白在植物體內(nèi)的亞細胞定位情況。主要研究結(jié)果如下：
　　1.基于NCBI登陸的5個茶樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（PRJNA167330、PRJNA223181、PRJNA51793、PRJNA170701、PRJNA261465）以及本實驗室通過高通量測序獲得的茶樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，結(jié)合基因功能注釋、PSPG box的44個保守氨基酸序列以及同源序列檢索等手段，共篩選得到178條CsUGTs基因，其中129條具有C末端保

4、守區(qū)。
　　2.利用MEGA6.0軟件對132條氨基酸序列長度在250~522之間的CsUGTs構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果顯示：茶樹中的UGTs可以被劃分為16個系統(tǒng)發(fā)育組（A-M、O、P、R）。較擬南芥和其他植物不同的是，茶樹中沒有發(fā)現(xiàn)N組和Q組，但是可以劃分出一個新的R組。利用Weblogo軟件對各系統(tǒng)發(fā)育組的茶樹UGTs與其他植物UGTs進行基序分析，得到PSPG box序列上保守氨基酸殘基出現(xiàn)相對頻率的分布圖。
　　3.在

5、茶樹UGT進化樹分析的結(jié)果上，本實驗選擇CsUGT84A22基因進行真核表達。將構(gòu)建成功的pYES-CsUGT84A22重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至真核表達菌株釀酒酵母WAT11。對半乳糖誘導后的酵母細胞充分破碎，高速離心取上清液進行酶活反應。HPLC技術(shù)檢測酶產(chǎn)物的結(jié)果表明：CsUGT84A22重組蛋白具有以UDP-葡萄糖為糖供體催化酚酸形成糖酯的活性。
　　4.在茶樹肉桂酸4-羥基化酶基因EST序列基礎上，通過RACE技術(shù)克隆了CsC4H基

6、因的全長序列，其中開放閱讀框長度為1518 bp，編碼505個氨基酸，預測蛋白的分子量為58.15 kD，理論等電點為9.29。利用基因組步移技術(shù)克隆得到CsC4H起始密碼子上游1840 bp的啟動子序列。該啟動子區(qū)域除了分布有TAAT-box和CAAT-box等基本轉(zhuǎn)錄元件外，還存在多個誘導型和組織特異型的順式作用元件。
　　5.實時熒光定量PCR結(jié)果表明：CsC4H基因在芽、葉、莖、根中都有表達。亞細胞定位結(jié)果表明：CsC4H