FGLmx-NEP1-40多肽緩釋體系的構(gòu)建及修復(fù)大鼠脊髓損傷的研究.pdf

1、本文分三個(gè)部分進(jìn)行探討：
　　第一部分：FGLmx/NEP1-40多肽緩釋體系的構(gòu)建、檢測(cè)及釋放規(guī)律的研究
　　目的：構(gòu)建FGLmx/NEP1-40多肽緩釋體系并研究其理化特性及釋放規(guī)律。
　　方法：合成自組裝多肽分子RADA16、RADA16-FGL及NEP1-40，并用高效液相色譜儀及質(zhì)譜儀分析純化。RADA16與RADA16-FGL溶液1:1混合后得到FGL功能化自組裝多肽FGLmx，基礎(chǔ)培養(yǎng)基觸發(fā)1％(10mg

2、/ml)FGLmx/NEP1-40多肽溶液自組裝，觀察自組裝后凝膠材料外形。用圓二色譜柱（Circular dichroism，CD）檢測(cè)FGLmx的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并用原子力顯微鏡(Atomic Force Microscope，AFM)檢測(cè)多肽材料的超微結(jié)構(gòu)。并觀察4種不同濃度緩釋體系(2％FGLmx/NEP1-40，1％FGLmx/NEP1-40，0.5％ FGLmx/NEP1-40及1％ RADA16/NEP1-40)對(duì)NEP1-40

3、的釋放規(guī)律，評(píng)估緩釋后的NEP1-40二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)變化。
　　結(jié)果：RADA16、RADA16-FGL及NEP1-40相對(duì)分子量為1712.78、3458.74及4584.16Da，純度均大于98％。AFM檢測(cè)證實(shí)FGLmx/NEP1-40自組裝后呈納米網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)。1％FGLmx/NEP1-40緩釋組釋放NEP1-40效率最高，且釋放后的NEP1-40二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)無明顯變化。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建緩釋體系FGLmx/NE

4、P1-40，且能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)NEP1-40的緩釋調(diào)控。
　　第二部分：FGLmx/NEP1-40多肽緩釋體系對(duì)脊髓來源神經(jīng)干細(xì)胞的生物相容性研究
　　目的：FGLmx/NEP1-40多肽緩釋體系與脊髓來源神經(jīng)干細(xì)胞（Spinal cord-derived neural stem cells, SC-NSCs）復(fù)合培養(yǎng)，研究其對(duì)SC-NSCs的存活、增殖、分化及遷移情況。
　　方法：原代培養(yǎng)SC-NSCs，將其接種在緩釋體系

5、1％FGLmx/NEP1-40上，培養(yǎng)第3天，live/dead試劑盒檢測(cè)SC-NSCs活細(xì)胞比例；用BrdU法評(píng)估SC-NSCs增殖情況；免疫熒光法檢測(cè)SC-NSCs自分化為神經(jīng)元及星型膠質(zhì)細(xì)胞情況；培養(yǎng)3天后，鈣黃綠素(Calcein-AM)染色，激光共聚焦顯微鏡觀察NSCs在材料中的遷移情況。
　　結(jié)果：SC-NSCs在各組中的活細(xì)胞比例無顯著性差異；BrdU檢測(cè)顯示各組細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間點(diǎn)逐漸增高，且FGLmx/NEP1-40組

6、培養(yǎng)的各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于其他組；培養(yǎng)第10天，SC-NSCs可在各組中自分化為神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞；培養(yǎng)3天后，鏡下見接種于FGLmx/NEP1-40和FGLmx表面的NSCs遷移到材料內(nèi)部。
　　結(jié)論：FGLmx/NEP1-40生物相容性好，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞無毒性，能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖、遷移，并能促進(jìn)SC-NSCs向神經(jīng)元方向自分化。FGLmx/NEP1-40可作為良好的神經(jīng)組織工程支架材料。
　　第三部分：FGLmx/NEP1

7、-40多肽緩釋體系修復(fù)大鼠脊髓損傷的研究
　　目的：建立大鼠脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)模型，將1％FGLmx/NEP1-40多肽緩釋體系植入到脊髓損傷局部，探討1％FGLmx/NEP1-40修復(fù)脊髓損傷的效果和機(jī)制。
　　方法：麻醉大鼠后，暴露T10水平脊髓，采用Allen打擊法制作SCI模型(T10)。在脊髓損傷局部，分別植入8μl10％Sucrose（空白組）、1％RADA16（RAD組）、

8、1％FGLmx（FGL組）和1％ FGLmx/NEP1-40（NEP組）溶液。術(shù)后8周內(nèi)每周一次分別采用BBB評(píng)分評(píng)估大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況，術(shù)后8周取脊髓損傷部位組織，行免疫熒光染色檢測(cè)GFAP/Laminin、GFAP/Fibronectin和GAP-43/5-HT，評(píng)估損傷部位疤痕形成、軸突再生及5-羥色胺能神經(jīng)纖維生長(zhǎng)情況；采用電鏡檢測(cè)脊髓病灶尾端髓鞘退變情況。
　　結(jié)果：成功建立大鼠胸髓撞擊損傷模型。BBB評(píng)分顯示各組評(píng)分

9、隨時(shí)間逐漸升高，自術(shù)后第5周起，NEP組評(píng)分顯著高于其他組，大鼠運(yùn)動(dòng)功能顯著改善。免疫熒光染色結(jié)果顯示，損傷后第8周，NEP組GFAP熒光強(qiáng)度顯著低于其他組，Laminin、Fibronectin及GAP43/5-HT熒光強(qiáng)度顯著高于其他組，損傷局部尾端髓鞘退變明顯低于其他組。
　　結(jié)論：FGLmx/NEP1-40多肽緩釋體系能促進(jìn)脊髓損傷大鼠的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)，能減少脊髓損傷部位星形膠質(zhì)疤痕的形成，促進(jìn)軸突再生及增強(qiáng)下行5-羥色胺能