FGLmx-NEP1-40多肽緩釋體系的構建及修復大鼠脊髓損傷的研究.pdf

1、本文分三個部分進行探討：
　　第一部分：FGLmx/NEP1-40多肽緩釋體系的構建、檢測及釋放規(guī)律的研究
　　目的：構建FGLmx/NEP1-40多肽緩釋體系并研究其理化特性及釋放規(guī)律。
　　方法：合成自組裝多肽分子RADA16、RADA16-FGL及NEP1-40，并用高效液相色譜儀及質譜儀分析純化。RADA16與RADA16-FGL溶液1:1混合后得到FGL功能化自組裝多肽FGLmx，基礎培養(yǎng)基觸發(fā)1％(10mg

2、/ml)FGLmx/NEP1-40多肽溶液自組裝，觀察自組裝后凝膠材料外形。用圓二色譜柱（Circular dichroism，CD）檢測FGLmx的二級結構，并用原子力顯微鏡(Atomic Force Microscope，AFM)檢測多肽材料的超微結構。并觀察4種不同濃度緩釋體系(2％FGLmx/NEP1-40，1％FGLmx/NEP1-40，0.5％ FGLmx/NEP1-40及1％ RADA16/NEP1-40)對NEP1-40

3、的釋放規(guī)律，評估緩釋后的NEP1-40二級及三級結構變化。
　　結果：RADA16、RADA16-FGL及NEP1-40相對分子量為1712.78、3458.74及4584.16Da，純度均大于98％。AFM檢測證實FGLmx/NEP1-40自組裝后呈納米網(wǎng)狀纖維結構。1％FGLmx/NEP1-40緩釋組釋放NEP1-40效率最高，且釋放后的NEP1-40二級及三級結構無明顯變化。
　　結論：成功構建緩釋體系FGLmx/NE

4、P1-40，且能夠實現(xiàn)對NEP1-40的緩釋調控。
　　第二部分：FGLmx/NEP1-40多肽緩釋體系對脊髓來源神經(jīng)干細胞的生物相容性研究
　　目的：FGLmx/NEP1-40多肽緩釋體系與脊髓來源神經(jīng)干細胞（Spinal cord-derived neural stem cells, SC-NSCs）復合培養(yǎng)，研究其對SC-NSCs的存活、增殖、分化及遷移情況。
　　方法：原代培養(yǎng)SC-NSCs，將其接種在緩釋體系

5、1％FGLmx/NEP1-40上，培養(yǎng)第3天，live/dead試劑盒檢測SC-NSCs活細胞比例；用BrdU法評估SC-NSCs增殖情況；免疫熒光法檢測SC-NSCs自分化為神經(jīng)元及星型膠質細胞情況；培養(yǎng)3天后，鈣黃綠素(Calcein-AM)染色，激光共聚焦顯微鏡觀察NSCs在材料中的遷移情況。
　　結果：SC-NSCs在各組中的活細胞比例無顯著性差異；BrdU檢測顯示各組細胞數(shù)隨時間點逐漸增高，且FGLmx/NEP1-40組

6、培養(yǎng)的各時間點均顯著高于其他組；培養(yǎng)第10天，SC-NSCs可在各組中自分化為神經(jīng)元和星型膠質細胞；培養(yǎng)3天后，鏡下見接種于FGLmx/NEP1-40和FGLmx表面的NSCs遷移到材料內部。
　　結論：FGLmx/NEP1-40生物相容性好，對神經(jīng)細胞無毒性，能促進神經(jīng)干細胞增殖、遷移，并能促進SC-NSCs向神經(jīng)元方向自分化。FGLmx/NEP1-40可作為良好的神經(jīng)組織工程支架材料。
　　第三部分：FGLmx/NEP1

7、-40多肽緩釋體系修復大鼠脊髓損傷的研究
　　目的：建立大鼠脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)模型，將1％FGLmx/NEP1-40多肽緩釋體系植入到脊髓損傷局部，探討1％FGLmx/NEP1-40修復脊髓損傷的效果和機制。
　　方法：麻醉大鼠后，暴露T10水平脊髓，采用Allen打擊法制作SCI模型(T10)。在脊髓損傷局部，分別植入8μl10％Sucrose（空白組）、1％RADA16（RAD組）、

8、1％FGLmx（FGL組）和1％ FGLmx/NEP1-40（NEP組）溶液。術后8周內每周一次分別采用BBB評分評估大鼠運動功能恢復情況，術后8周取脊髓損傷部位組織，行免疫熒光染色檢測GFAP/Laminin、GFAP/Fibronectin和GAP-43/5-HT，評估損傷部位疤痕形成、軸突再生及5-羥色胺能神經(jīng)纖維生長情況；采用電鏡檢測脊髓病灶尾端髓鞘退變情況。
　　結果：成功建立大鼠胸髓撞擊損傷模型。BBB評分顯示各組評分

9、隨時間逐漸升高，自術后第5周起，NEP組評分顯著高于其他組，大鼠運動功能顯著改善。免疫熒光染色結果顯示，損傷后第8周，NEP組GFAP熒光強度顯著低于其他組，Laminin、Fibronectin及GAP43/5-HT熒光強度顯著高于其他組，損傷局部尾端髓鞘退變明顯低于其他組。
　　結論：FGLmx/NEP1-40多肽緩釋體系能促進脊髓損傷大鼠的運動功能恢復，能減少脊髓損傷部位星形膠質疤痕的形成，促進軸突再生及增強下行5-羥色胺能