小鼠體外受精胚與體內(nèi)胚Oct4基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化差異的研究.pdf

1、DNA甲基化是表觀遺傳修飾的主要形式之一，對(duì)哺乳動(dòng)物的正常發(fā)育至關(guān)重要。體細(xì)胞中DNA甲基化模式是穩(wěn)定的，但在早期胚胎中：DNA會(huì)發(fā)生去甲基化和再甲基化。Oct4是一種與胚胎發(fā)育相關(guān)的多能調(diào)控因子，它在建立和維持細(xì)胞多能性方面起著重要作用。本試驗(yàn)以O(shè)ct4基因作為候選基因，運(yùn)用亞硫酸氫鹽測(cè)序法，對(duì)小鼠體細(xì)胞、生殖細(xì)胞以及早期胚胎發(fā)育過(guò)程中各個(gè)時(shí)期Dct4啟動(dòng)子區(qū)甲基化進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)其在體內(nèi)和體外受精 (in vitro felliliz

2、ation，IVF)胚中的甲基化進(jìn)行比較。 試驗(yàn)的各種檢測(cè)材料經(jīng)低熔點(diǎn)瓊脂糖包埋、亞硫酸氫鹽變性處理后進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，然后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化、連接、轉(zhuǎn)化于感受態(tài)大腸桿菌中。對(duì)轉(zhuǎn)化后的菌體進(jìn)行菌體PCR鑒定，將有特異性條帶的菌液送檢測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析的結(jié)果表明：(1)體細(xì)胞基因組中Oct4啟動(dòng)子區(qū)呈高度甲基化狀態(tài)(73.8±5.9％，平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)，極顯著高于精子和卵子(P<0.01)；精子和卵子之間甲基化水平也存在

3、顯著差異(P<0.05)，精子中略微甲基化(18.75±4.1％)，而卵子中基本上是非甲基化的(2.5±1.4％)。(2)小鼠體內(nèi)各時(shí)期胚胎Oct4啟動(dòng)子區(qū)均呈低甲基化狀態(tài)，2-細(xì)胞、4-細(xì)胞、8-/16-細(xì)胞和桑椹胚時(shí)期甲基化水平分別為5.63±2.5％、4.38±2.0％、3.75±1.4％、1.88±0.2％，甲基化逐漸丟失，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)；而在囊胚期，Oct4啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平顯著升高(6.88±2.4％，P<0

4、.05)，重新甲基化開始。(3)小鼠體外受精胚與體內(nèi)胚甲基化模式相似，其各時(shí)期胚胎Oct4啟動(dòng)子區(qū)也呈低甲基化狀態(tài)，從2-細(xì)胞至桑椹胚，隨著胚胎發(fā)育而呈下降趨勢(shì)，相互之間差異不顯著(P>0.05)，分別為11.25±4.5％(2-細(xì)胞)、6.25±2.1％(4-細(xì)胞)、5.63±3.7％(8-16-細(xì)胞)、1.88±0.2％(桑椹胚)；而在囊胚期，甲基化水平顯著升高(7.5±2.4％，P<0.05)。(4)對(duì)比體外與體內(nèi)各時(shí)期胚胎Oct