人抗凝血酶Ⅲ基因轉染血管內皮樣細胞并表達的實驗研究.pdf

1、第一部分人骨髓間充質干細胞定向誘導分化為血管內皮樣細胞的實驗研究 [目的] 本研究擬通過體外分離和純化成人骨髓間充質干細胞，體外定向誘導分化為血管內皮樣細胞，探討為組織工程血管的構建提供內皮細胞種子細胞的可能性。 [方法] 1、成人骨髓間充質干細胞的分離、培養(yǎng)和擴增： 收集骨髓血，采用密度梯度離心+貼壁培養(yǎng)法提取單個核細胞進行體外培養(yǎng)擴增。 2、定向誘導間充質干細胞向內皮樣細胞分化：用含

2、10n咖1 VEGF培養(yǎng)液誘導細胞，連續(xù)誘導觀察11天。 [結果] 1、間充質干細胞特性本實驗分析了5個標本，每個標本體外擴增10代可獲細胞數(shù)為8×10<'10>個左右；細胞高表達CD105、CD29和CD44，弱表達KDR。 2、誘導間充質干細胞向內皮樣細胞定向分化誘導14天后細胞vwF強陽性表達；接近融合細胞外觀呈現(xiàn)為特征性的鵝卵石樣形態(tài)；透射電鏡顯示胞質內可見大量的吞飲小泡：將誘導后14天細胞接種在細胞外基

3、質凝膠(ECMgel)中可形成毛細血管樣結構。 [結論] 1、采用密度梯度離心+貼壁培養(yǎng)法，可以獲得足夠量較為單一、具有較強增殖能力的間充質干細胞。 2、問充質干細胞可以在體外定向分化為具有內皮細胞特性的細胞，可以作為組織工程化血管內皮細胞的種子細胞來源。 第二部分人骨髓間充質干細胞來源的血管內皮樣細胞與人臍靜脈來源的血管內皮細胞主要抗凝基因表達對比的實驗研究 [目的]觀察不同來源的血管內

4、皮細胞抗凝能力的差異。 [方法] 1、采用密度梯度離心及貼壁培養(yǎng)法對人骨髓間充質干細胞(BMMSCs)進行體外培養(yǎng)、純化和擴增，用含有VEGF(10ng/ml)的誘導培養(yǎng)液對其進行體外誘導分化產(chǎn)生血管內皮樣細胞； 2、采用膠原酶消化法獲取和體外培養(yǎng)人臍靜脈血管內皮細胞(HUVECs)； 3、用RT-PCR法檢測BMMSCs來源的血管內皮樣細胞及HuVECs的主要抗凝血基因(組織纖溶酶原激活物、組織因子途徑

5、抑制因子、抗凝血酶Ⅲ及內皮型一氧化氮合酶)mRNA的表達。 [結果] 1、BMMSCs能夠在體外成功誘導分化為血管內皮樣細胞，但不表達主要抗凝基因的mRNA； 2、 HUVECs能夠表達這些基因的mRNA。 [結論] BMMsCs能夠成功誘導分化為血管內皮樣細胞，但它的抗凝能力較HUVECs弱。 第三部分人抗凝血酶III基因轉染血管內皮樣細胞并表達的實驗研究 [目的] 將人抗凝血酶

6、Ⅲ(hAT-Ⅲ)基因導入由BMMSCs誘導產(chǎn)生的血管內皮樣細胞(VELCs)，并觀察它的表達情況，為提高組織工程化血管抗血栓能力的基因治療提供實驗基礎。 [方法] 1、采用脂質介導的DNA轉染方法將含有hAT-Ⅲ基因的質粒DNA pBLAST49-hAT3導入由BMMSCs誘導產(chǎn)生的VELCs； 2、對轉染后的VELCs進行RT-PCR、免疫組化、Westen-Blot以及AT-Ⅲ的活性檢測，觀察hAT-Ⅲ的表達

7、情況。 [結果] 1、RT-PCR檢測顯示，轉染后第72、96 h的VELCs能夠表達hAT-Ⅲ基因的mRNA； 2、免疫組化染色顯示，轉染后第72、96 h的VELCs陽性表達AT-Ⅲ； 3、Westen-Blot檢測顯示，轉染后第72、96 h的VELCs細胞培養(yǎng)上清液陽性表達AT-Ⅲ： 4、活性檢測顯示，轉染后第72、96 h的VELCs細胞培養(yǎng)上清液有AT-Ⅲ低活性。 [結論]