人抗凝血酶Ⅲ基因轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮樣細(xì)胞并表達(dá)的實驗研究.pdf

1、第一部分人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮樣細(xì)胞的實驗研究 [目的] 本研究擬通過體外分離和純化成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，體外定向誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮樣細(xì)胞，探討為組織工程血管的構(gòu)建提供內(nèi)皮細(xì)胞種子細(xì)胞的可能性。 [方法] 1、成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增： 收集骨髓血，采用密度梯度離心+貼壁培養(yǎng)法提取單個核細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增。 2、定向誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向內(nèi)皮樣細(xì)胞分化：用含

2、10n咖1 VEGF培養(yǎng)液誘導(dǎo)細(xì)胞，連續(xù)誘導(dǎo)觀察11天。 [結(jié)果] 1、間充質(zhì)干細(xì)胞特性本實驗分析了5個標(biāo)本，每個標(biāo)本體外擴(kuò)增10代可獲細(xì)胞數(shù)為8×10<'10>個左右；細(xì)胞高表達(dá)CD105、CD29和CD44，弱表達(dá)KDR。 2、誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向內(nèi)皮樣細(xì)胞定向分化誘導(dǎo)14天后細(xì)胞vwF強(qiáng)陽性表達(dá)；接近融合細(xì)胞外觀呈現(xiàn)為特征性的鵝卵石樣形態(tài)；透射電鏡顯示胞質(zhì)內(nèi)可見大量的吞飲小泡：將誘導(dǎo)后14天細(xì)胞接種在細(xì)胞外基

3、質(zhì)凝膠(ECMgel)中可形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)。 [結(jié)論] 1、采用密度梯度離心+貼壁培養(yǎng)法，可以獲得足夠量較為單一、具有較強(qiáng)增殖能力的間充質(zhì)干細(xì)胞。 2、問充質(zhì)干細(xì)胞可以在體外定向分化為具有內(nèi)皮細(xì)胞特性的細(xì)胞，可以作為組織工程化血管內(nèi)皮細(xì)胞的種子細(xì)胞來源。 第二部分人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的血管內(nèi)皮樣細(xì)胞與人臍靜脈來源的血管內(nèi)皮細(xì)胞主要抗凝基因表達(dá)對比的實驗研究 [目的]觀察不同來源的血管內(nèi)

4、皮細(xì)胞抗凝能力的差異。 [方法] 1、采用密度梯度離心及貼壁培養(yǎng)法對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSCs)進(jìn)行體外培養(yǎng)、純化和擴(kuò)增，用含有VEGF(10ng/ml)的誘導(dǎo)培養(yǎng)液對其進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化產(chǎn)生血管內(nèi)皮樣細(xì)胞； 2、采用膠原酶消化法獲取和體外培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)； 3、用RT-PCR法檢測BMMSCs來源的血管內(nèi)皮樣細(xì)胞及HuVECs的主要抗凝血基因(組織纖溶酶原激活物、組織因子途徑

5、抑制因子、抗凝血酶Ⅲ及內(nèi)皮型一氧化氮合酶)mRNA的表達(dá)。 [結(jié)果] 1、BMMSCs能夠在體外成功誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮樣細(xì)胞，但不表達(dá)主要抗凝基因的mRNA； 2、 HUVECs能夠表達(dá)這些基因的mRNA。 [結(jié)論] BMMsCs能夠成功誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮樣細(xì)胞，但它的抗凝能力較HUVECs弱。 第三部分人抗凝血酶III基因轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮樣細(xì)胞并表達(dá)的實驗研究 [目的] 將人抗凝血酶

6、Ⅲ(hAT-Ⅲ)基因?qū)胗葿MMSCs誘導(dǎo)產(chǎn)生的血管內(nèi)皮樣細(xì)胞(VELCs)，并觀察它的表達(dá)情況，為提高組織工程化血管抗血栓能力的基因治療提供實驗基礎(chǔ)。 [方法] 1、采用脂質(zhì)介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)染方法將含有hAT-Ⅲ基因的質(zhì)粒DNA pBLAST49-hAT3導(dǎo)入由BMMSCs誘導(dǎo)產(chǎn)生的VELCs； 2、對轉(zhuǎn)染后的VELCs進(jìn)行RT-PCR、免疫組化、Westen-Blot以及AT-Ⅲ的活性檢測，觀察hAT-Ⅲ的表達(dá)

7、情況。 [結(jié)果] 1、RT-PCR檢測顯示，轉(zhuǎn)染后第72、96 h的VELCs能夠表達(dá)hAT-Ⅲ基因的mRNA； 2、免疫組化染色顯示，轉(zhuǎn)染后第72、96 h的VELCs陽性表達(dá)AT-Ⅲ； 3、Westen-Blot檢測顯示，轉(zhuǎn)染后第72、96 h的VELCs細(xì)胞培養(yǎng)上清液陽性表達(dá)AT-Ⅲ： 4、活性檢測顯示，轉(zhuǎn)染后第72、96 h的VELCs細(xì)胞培養(yǎng)上清液有AT-Ⅲ低活性。 [結(jié)論]