由18個堿基缺失導致I型遺傳性抗凝血酶缺乏癥的基因和功能分析.pdf

1、本文從以下幾個方面進行論述。
　　第一部分：
　　目的:
　　抗凝血酶作為抗凝血系統(tǒng)中不可或缺的一種蛋白酶，其家系的研究可為出凝血的遺傳性疾病提供有力的依據(jù)。而本次研究探討1例Ⅰ型遺傳性抗凝血酶(AT)缺陷癥家系的表型及基因型關系。
　　方法：
　　1)對遺傳性抗凝血酶缺乏癥患者及家系成員進行血常規(guī)，凝血功能，D-Dimer水平的檢測，并采集病史。
　　2)用ELISA法檢測血漿中抗凝血酶抗原（AT:

2、Ag），蛋白C抗原（PC:Ag)，用發(fā)色底物法檢測血漿中抗凝血酶活性（AT:A）和蛋白C活性(PC:A），凝固法檢測蛋白S活性（PS:A）。
　　3)利用凝血酶生成通過擴增和限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應技術（PCR-RFLP）對新發(fā)現(xiàn)的突變位點的進行驗證。
　　7）通過測序檢測家系中是否存在其它常見的遺傳性凝血因子突變位點。
　　8）生物信息軟件 Sorting Intolerant From Tolerant(S

3、IFT)， Polymorphism Phentyping-2(PolyPhen-2)，Mutation Taster和Protein Variation Effect Analyzer（PROVEAN）對缺失突變的評估，DNAMAN軟件對突變氨基酸保守度分析和Swiss Model對蛋白分子結構模擬。
　　結果：
　　1）該家系的先證者為反復發(fā)作的靜脈血栓患者，但家系其他成員均無血栓發(fā)生。先證者入院接受抗凝治療后凝血功能提

4、示PT，APTT，INR均延長，分別為26.6s，48.6s和2.57，其血常規(guī)，D-Dimer水平檢查結果均無異常，家系其他成員血常規(guī)，凝血功能，D-Dimer水平均無異常。
　　2）先證者的AT:A為正常人(100％)的39.2％，AT:Ag為正常人（100％）的41.9％，提示為I型遺傳性抗凝血酶缺乏。家系成員中先證者的母親和侄女的AT:A和AT:Ag均有所降低，其余成員無異常。
　　3）凝血酶生成實驗結果顯示先證者及

5、其母親和侄女的峰值高于正常人群，提示其血液存在高凝狀態(tài)。
　　4）先證者的DNA抽提后，通過AT基因測序顯示在AT第5個外顯子(外顯子5)存在18個堿基缺失突變,導致c.1061_1078del。其母親和侄女均存在相同雜合突變。
　　5）TA克隆測序發(fā)現(xiàn)一條正常DNA鏈和一條18個堿基缺失的DNA鏈。
　　6）酶切結果提示100例正常人中未見此雜合突變，證明該突變不是基因多態(tài)性。
　　7）檢測遺傳性凝血因子的常見

6、突變位點，測序結果顯示先證者及其父親和侄女均存在纖維蛋白原FGG C10034T雜合突變，先證者及其母親存在MTHFR C667T雜合突變，所有人均未發(fā)現(xiàn)FV Leiden突變和PT G20210A突變。
　　8）通過生物信息學軟件比對后提示是一個病理性的有害突變。
　　結論：
　　根據(jù)先證者臨床癥狀、體征，結合家族史及實驗室檢測結果，診斷為遺傳性抗凝血酶缺乏癥，并通過抗凝血酶抗原和活性的檢測確定為I型遺傳性抗凝血酶缺

7、乏癥。AT基因第5個外顯子（外顯子5）出現(xiàn)的AT c.1061_1078del雜合突變，為國際上首次報道。同時先證者的母親和侄女（胞妹的女兒）也存在該位點的雜合突變，說明該突變來源于先證者母親，通過基因和蛋白水平的調控，造成血液的高凝狀態(tài)。
　　第二部分
　　目的：研究該雜合突變導致遺傳性抗凝血酶缺乏癥的分子機制，并對AT的結構和功能的變化進行體外功能實驗的分析。完善疾病的診斷治療和預后方案，加深對疾病的認識。
　　方

8、法：
　　1）構建AT野生型和突變型重組表達質粒。
　　2）細胞培養(yǎng)，分別將AT的野生型及突變型重組表達質粒，與eGFP-PEZ-M02質粒共同瞬時轉染到HEK293T細胞。
　　3）qRT-PCR法檢測轉染后細胞轉錄水平的表達。
　　4）蛋白印跡分析細胞培養(yǎng)基上清中AT的含量和相對分子量。5）間接免疫熒光和激光共聚焦對AT蛋白進行亞細胞定位。
　　6）通過發(fā)色底物法和ELISA的方法檢測轉染后細胞上清的A

9、T活性和抗原。
　　結果：
　　1)構建的野生型表達質粒為AT-WT，突變型重組表達質粒為AT-MT。
　　2)通過共同轉染，熒光顯微鏡觀察HEK293T細胞，轉染效率基本相同，約為80％。
　　3)蛋白印跡結果顯示突變型重組表達質粒在細胞上清中分泌的蛋白分子量和表達量均低于野生型。
　　4) qRT-PCR法檢測轉染AT-MT的細胞轉錄水平明顯降低，約為野生型AT-WT的0.125倍。
　　5)免疫

10、熒光結果顯示突變型AT-MT表達的AT蛋白在細胞內質網(wǎng)的染色程度與野生型相似，但在高爾基復合體的染色較野生型明顯減弱。
　　6)突變型AT-MT的細胞上清中AT:Ag和AT:A均明顯低于野生型。
　　結論：
　　體外功能研究證實18個堿基的缺失是造成患者血漿中抗凝血酶缺乏的根本原因。該突變引起細胞內ATmRNA表達下降，并且在高爾基復合體加工過程中導致分泌蛋白的含量和活性同時減少。先證者需及時給予抗凝治療，制定長期抗凝