Survivin在膀胱腫瘤早期診斷，預(yù)后判斷以及細(xì)胞凋亡方面的作用.pdf

1、腫瘤是以細(xì)胞分裂，細(xì)胞死亡和細(xì)胞與細(xì)以及細(xì)胞與基質(zhì)相互作用嚴(yán)重失調(diào)為特征的一類疾病。腫瘤的發(fā)生，發(fā)展與細(xì)胞的凋亡，增殖調(diào)節(jié)失控密切相關(guān)。Survivin是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的凋亡因子，是凋亡蛋白抑制因子(inhibitorofapoptosisprotein)家族的成員，由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，特殊的組織分布，以及明顯的抗凋亡生物學(xué)作用引起了腫瘤研究者的廣泛關(guān)注。目前很少有關(guān)于腫瘤標(biāo)記物來進(jìn)行腫瘤的早期診斷，那么早期診斷，尤其是無創(chuàng)傷性診斷更

2、為有意義。 膀胱腫瘤是泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤，50％-70％的病人手術(shù)后復(fù)發(fā)，10-20％復(fù)發(fā)的腫瘤惡性程度增加。臨床上，膀胱腫瘤的病理分期及細(xì)胞分級(jí)對(duì)于腫瘤的診斷，治療及預(yù)后判斷很重要，但是還沒有一個(gè)真正在臨床可以應(yīng)用的生物學(xué)標(biāo)志物，目前臨床用于診斷膀胱癌的金標(biāo)準(zhǔn)是膀胱鏡檢查。膀胱鏡檢具有侵襲性，疼痛。尿細(xì)胞學(xué)檢測(cè)特異性雖高，敏感性只有40％-60％。尤其在低分化腫瘤中更低。因此找到一種膀胱腫瘤的標(biāo)志物應(yīng)用于臨床很重要。

3、 凋亡在正常細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生與內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面起重要的作用。腫瘤的發(fā)生，發(fā)展與細(xì)胞凋亡，增殖調(diào)節(jié)失控有關(guān)凋亡的減弱，可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)，轉(zhuǎn)移。通過異常的增強(qiáng)細(xì)胞的生存能力誘發(fā)基因突變，增加對(duì)免疫為基礎(chǔ)的細(xì)胞毒性的抵抗力，引起的凋亡抑制可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生及進(jìn)展。早期的研究主要集中在Bcl家族。Bcl-2是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的，通過抑制凋亡，延長(zhǎng)細(xì)胞生存周期的凋亡抑制基因。除此之外，由于目前發(fā)現(xiàn)的凋亡蛋白抑制因子(inhibitorofapoptos

4、isproteins，IAPs)家族的廣泛組織分布，明顯的抗凋亡作用，引起了廣泛重視，在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。 Survivin基因是一種新的凋亡抑制基因，屬于IAP家族成員之一，在許多類型的癌細(xì)胞中表達(dá)。定位于人17q25染色體的Survivin基因?qū)儆诘蛲龅鞍滓种埔蜃蛹易?，是Ambrósini等于1997年利用效應(yīng)細(xì)胞蛋白酶受體1(EPR-1)cDNA在人類基因組庫的雜交篩選中分離出來的一種凋亡基因。全長(zhǎng)14.7kb

5、，含有3個(gè)內(nèi)顯子和4個(gè)外顯子，編碼含有142個(gè)氨基酸，分子量為16.5KD的細(xì)胞質(zhì)蛋白(4)。它是近年來發(fā)現(xiàn)的一個(gè)調(diào)節(jié)細(xì)胞調(diào)亡的蛋白質(zhì)家族8個(gè)成員(即XIAP，HIAP1，HIAP2，NAIP，Survivin，Livin，Ts-IAP和Apollon(5))之一。IAPs蛋白結(jié)構(gòu)中包含2個(gè)或3個(gè)串聯(lián)，含有半胱氨酸/組氨酸的桿狀病毒凋亡抑制蛋白重復(fù)區(qū)系列(baculovirusIAPrepeat，BIR)，其羧基末端有一個(gè)由80個(gè)氨基酸

6、組成的保守的鋅結(jié)合區(qū)域.稱為鋅指環(huán)結(jié)構(gòu)，其中主要是BIR區(qū)結(jié)構(gòu)發(fā)揮抗凋亡作用。除抑制凋亡外，IAPs還參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)及受體介導(dǎo)的信號(hào)傳遞。Survivin是IAPs家族成員中結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的蛋白分子，它只有一個(gè)BIR結(jié)構(gòu)，羧基端無鋅指環(huán)結(jié)構(gòu)，而有一個(gè)由40個(gè)氨基酸組成的α螺旋結(jié)構(gòu)。 在100多種腫瘤特異性表達(dá)基因中，其表達(dá)的特異性列前4位。在腫瘤形成過程中與抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖雙重作用，早期出現(xiàn)于腫瘤組織細(xì)胞中，并成為某些

7、腫瘤預(yù)后不良的標(biāo)志。 本實(shí)驗(yàn)就是在研究Survivin基因在膀胱癌中的表達(dá)外，進(jìn)一步研究尿中該基因的表達(dá)情況，找到一種膀胱腫瘤早期診斷的標(biāo)記物，并對(duì)膀胱腫瘤的預(yù)后做出判斷，以及抗癌藥物絲裂霉素(MMC)，羥基喜樹鹼(HCPT)，對(duì)膀胱腫瘤的調(diào)亡以及Survivin表達(dá)的影響。 方法：手術(shù)標(biāo)本40例。所有病人均經(jīng)膀胱鏡及病理確定診斷。手術(shù)前未進(jìn)行化療，放療以及免疫治療。膀胱癌病人中，原發(fā)腫瘤33例，復(fù)發(fā)腫瘤7例，單發(fā)腫瘤3

8、0例，多發(fā)腫瘤10例。6例行膀胱全切術(shù)，16例行膀胱部分切除術(shù)，18例行經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)。臨床分期按UICC標(biāo)準(zhǔn)，表淺膀胱癌(Tis-T1)22例，浸潤(rùn)性膀胱癌(T2-T4)18例。病理分級(jí)按WHO標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ級(jí)16例，Ⅱ級(jí)18例，Ⅲ級(jí)6例。正常膀胱組織標(biāo)本取自前列腺增生癥手術(shù)患者。應(yīng)用免疫組織化學(xué)，檢測(cè)Survivin的陽性表達(dá)率，RT-PCR，檢測(cè)SurvivinmRNA的表達(dá)，以β-actin為參照，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。用GIS

9、-700D型凝膠圖象處理系統(tǒng)掃描電泳結(jié)果，以內(nèi)參的吸光度值標(biāo)化目的產(chǎn)物吸光度值，得到目的產(chǎn)物相對(duì)含量。Westernblot檢測(cè)Survivin蛋白的表達(dá)凝膠圖象分析系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。 取正常人尿液30例，膀胱癌病人尿液30例，其他泌尿系疾病病人尿液30例，治療后膀胱癌組20例。所有病人經(jīng)膀胱鏡檢，病理等確診。應(yīng)用RT-PCR方法，尿液(100毫升)離心，收集尿脫落細(xì)胞，提取總RNA，然后進(jìn)行RNA擴(kuò)增，檢測(cè)SurvivinmR

10、NA的表達(dá)，以β-actin為參照，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。用GIS-700D型凝膠圖象處理系統(tǒng)掃描電泳結(jié)果，以內(nèi)參的吸光度值標(biāo)化目的產(chǎn)物吸光度值，得到目的產(chǎn)物相對(duì)含量。 細(xì)胞培養(yǎng)：人膀胱癌細(xì)胞EJ和BIU細(xì)胞用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，增補(bǔ)青霉素100U/ml，鏈霉素100g/ml，在37℃，5％CO2和100％濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞每5天傳代一次，按1∶2和1∶4的比例傳代細(xì)胞。 用流式細(xì)胞儀測(cè)定EJ

11、細(xì)胞凋亡數(shù)量：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EJ細(xì)胞，棄去舊的培養(yǎng)液；在每個(gè)瓶?jī)?nèi)加人2-3的PBS，反復(fù)洗滌2次，加入2-3的0.25的胰酶；消化2-3分鐘，使貼壁細(xì)胞脫落。加等量的含10％FBS的1640培養(yǎng)液。將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的細(xì)胞懸液移至離心管內(nèi)，1000rpm，5分鐘離心。棄去上清夜，將細(xì)胞懸液移至一個(gè)離心管內(nèi)，取0.1ml細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞記數(shù)，共記三次，取平均值，2-5×106個(gè)/ml。將調(diào)整好細(xì)胞數(shù)的細(xì)胞懸液加入到24孔板中，每孔加入細(xì)胞懸液0

12、.9ml，每組兩個(gè)給藥組，兩個(gè)對(duì)照組，給藥組分別加入100μl的MMC，HCPT，濃度分別為0.05，0.10，0.20，0.50mg/ml，對(duì)照組分別加入等量的生理鹽水100μl。在給藥后0h，12h，24h，48h，分別收集各孔內(nèi)的細(xì)胞，須經(jīng)過胰酶消化處理，使貼壁細(xì)胞脫落。然后將各組細(xì)胞懸液移至5ml的離心管內(nèi)，把樣品上機(jī)檢測(cè)不同時(shí)間段MMC，HCPT引起膀胱癌細(xì)胞凋亡變化。 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)化療藥物作用于EJ細(xì)胞系前后

13、，survivin的變化：取培養(yǎng)的細(xì)胞，PBS洗滌，加入胰酶，離心，棄上清液，將細(xì)胞懸液滴人載玻片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。然后取藥物處理過的，濃度為0.20mg/ml，給藥時(shí)間為48小時(shí)的細(xì)胞，再次行免疫組織化學(xué)檢測(cè)，并比較用藥前后survivin細(xì)胞的陽性率。每張切片在放大400倍鏡下隨機(jī)讀取1000個(gè)細(xì)胞(不含壞死組織的視野)，陽性細(xì)胞率=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100％。＞5％為陽性，5％～15％(+)，15％～30％(2+)，30

14、％～45％(3+)，＞45％(4+)。 結(jié)果： 1.免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果：表淺膀胱腫瘤(Tis-T1)Survivin表達(dá)陽性率：66.6％；侵潤(rùn)性膀胱腫瘤(T2-T4)Survivin表達(dá)陽性率：77.2％。細(xì)胞分級(jí)：G1：57.1％，G2：56.3％，G3：60％。差異均無顯著性。正常組織中則為陰性。 2.Westernblot檢測(cè)結(jié)果：在膀胱癌組織中，檢測(cè)到Survivin分子量為16.5Kd的一條帶。而在

15、正常膀胱組織中則沒有檢測(cè)到。 3.RT-PCR結(jié)果：在所有膀胱癌標(biāo)本中，SurvivinmRNA經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后，均檢測(cè)到一個(gè)279bp的特異性條帶，而在正常對(duì)照組則無。 4.膀胱癌病人尿PCR產(chǎn)物凝膠電泳，279bp處出現(xiàn)清晰條帶，無非特異性條帶。正常對(duì)照尿液.以及其他泌尿系疾病RT-PCR電泳無條帶出現(xiàn)。 5.MMC和HCPT均能引起膀胱癌EJ細(xì)胞凋亡，在不同時(shí)間的凋亡率類似。 6.MMC用藥前，

16、后四個(gè)視野，survivin細(xì)胞陽性表達(dá)率比較明顯下降(P＜0.05)。HCPT用藥前.后四個(gè)視野，survivin細(xì)胞陽性表達(dá)率沒有顯著變化(P＞0.05)。 結(jié)論： 1.Survivin的過度表達(dá)與膀胱癌的發(fā)生及發(fā)展有密切關(guān)系。 2.Survivin的表達(dá)與膀胱腫瘤分級(jí)，病理分期無關(guān)。 3.尿中Survivin的表達(dá)與膀胱腫瘤中的表達(dá)一致。 4.Survivin可能成為膀胱癌早期診斷，判斷預(yù)后