新型納米藥物載體在逆轉腫瘤細胞耐藥性方面的應用研究.pdf

1、第一部分、載有槲皮素的PEG-PE膠束對乳腺癌細胞耐藥性的逆轉效應
　　目的：乳腺癌是嚴重威脅女性健康的常見腫瘤。雖然近年來在其診斷及治療方面有了長足的進步，但乳腺癌患者的死亡率仍然居高不下，其中一個主要的原因就是腫瘤細胞可產(chǎn)生多藥耐藥性(Multidrug resistance，MDR)，大幅減弱化療藥物對腫瘤細胞的殺傷，從而導致90％的晚期腫瘤化療的失敗。槲皮素(Quercetin，Q)是一種天然的黃酮類化合物，有研究顯示，槲

2、皮素有助于逆轉腫瘤細胞的多藥耐藥性。然而，由于槲皮素水溶性差、吸收差，限制了其在臨床上的應用，因而迫切需要開發(fā)能夠在水溶液中穩(wěn)定存在的高效載藥系統(tǒng)來運載槲皮素。聚合物膠束是近年來出現(xiàn)的一種新型納米藥物載體，同時具有親水性外殼和疏水性內核，具有多種優(yōu)良的性能，如在體內外環(huán)境中較高的穩(wěn)定性、對難溶性藥物的增溶作用等。聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)是經(jīng)美國食品和藥物管理局(Foodand Drug Administration，F(xiàn)

3、DA)批準的可用于人體的藥物載體材料，具有良好的生物相容性和安全性。然而，迄今為止尚未有對于載有槲皮素的PEG-PE膠束逆轉腫瘤細胞耐藥性的報道。本研究利用PEG-PE膠束可攜帶難溶性藥物的特性，制備出載有槲皮素的PEG-PE膠束(quercetin-loaded PEG-PE Micelles，M-Q)，并在體外初步評估了其對耐阿霉素人乳腺癌細胞(MCF-7 ADRr)耐藥性的逆轉效應。
　　方法：將mPEG2000-PE和槲皮

4、素分別溶于三氯甲烷和無水乙醇中，以不同的濃度比混合此兩種有機溶液，然后將混合溶液置于氮氣環(huán)境下蒸發(fā)至形成一層均勻干燥薄膜，靜置2h之后，加入0.9％氯化鈉注射液使薄膜水合。50℃水浴下水化30min后，常溫靜置2h，即制備出M-Q。用動態(tài)光散射儀表征其尺寸分布及Zeta電位;采用超速離心法分離游離藥物后以紫外分光光度法測定其包封率;將其聯(lián)合阿霉素一起與MCF-7 ADRr細胞共孵育72h，用MTS方法檢測腫瘤細胞的存活率，并測定其對MC

5、F-7 ADRr細胞耐藥性的逆轉作用是否優(yōu)于游離槲皮素;為評價PEG-PE膠束自身對靶細胞有無殺傷作用，將MCF-7 ADRr細胞分別與不同濃度的PEG-PE膠束孵育72h，用MTS方法檢測腫瘤細胞的存活率。
　　結果：
　　(1)利用動態(tài)光散射儀分別測定了空膠束和載藥膠束的粒徑，結果顯示，空膠束與載藥膠束的粒徑相似，無明顯差異，平均粒徑在11.11nm左右，空膠束與載藥膠束的Zeta電位分別為-0.165mV和-0.406

6、mV。
　　(2)PEG-PE聚合物膠束能有效運載槲皮素，其包封率高達74％以上。
　　(3)MTS殺傷結果顯示，M-Q能在體外有效逆轉MCF-7 ADRr細胞對于阿霉素的耐藥性，且其逆轉作用優(yōu)于游離槲皮素(p＜0.05)。
　　(4)本實驗中所用的PEG-PE膠束的安全性較好，在15-120μmol/L的濃度范圍內，對MCF-7 ADRr細胞無明顯殺傷作用。
　　結論：載有槲皮素的PEG-PE膠束能夠在體外有效

7、逆轉MCF-7 ADRr細胞對于阿霉素的耐藥性，且其逆轉作用顯著優(yōu)于游離槲皮素。該結果提示，載有槲皮素的PEG-PE膠束在逆轉腫瘤耐藥性方面具有潛在的應用價值。
　　第二部分、載有阿霉素的DNA四面體對肺癌細胞耐藥性的逆轉效應
　　目的：肺癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在男性居惡性腫瘤的第1位，在女性居第2位。近十年來，肺癌的發(fā)病率和死亡率一直處于持續(xù)增長的狀態(tài)。令人擔憂的是，即使經(jīng)過治療，肺癌患者的五年存

8、活率依然低于15％?；熓峭砥诜伟┑闹饕委煼椒ㄖ?，然而肺癌化療的效果并不十分理想，導致化療失敗的主要原因之一是腫瘤細胞多藥耐藥性(Multidrug resistance，MDR)的產(chǎn)生。為了克服腫瘤細胞的MDR，人們一直在探索新型的納米載藥系統(tǒng)來提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。DNA納米技術已逐漸成為納米醫(yī)學研究的熱點。DNA納米技術的快速發(fā)展使得DNA作為一種優(yōu)勢材料被廣泛使用。通過利用堿基配對法則，設計并合成大量不同幾何結構的

9、DNA納米結構。在眾多DNA納米結構中，由于DNA四面體具有簡易自組裝及高產(chǎn)的優(yōu)良特性，被認為是最實用的DNA納米結構之一。迄今為止，尚未有DNA四面體對肺癌細胞耐藥性影響的評估，本研究利用DNA四面體的高效自組裝特性以及阿霉素自動嵌入DNA的特性，構建出載有阿霉素的DNA四面體，并在體外初步評估了其對耐阿霉素人肺腺癌細胞(A549 ADRr)耐藥性的逆轉效應。
　　方法：將溶解于TE緩沖液的4條單鏈DNA(A、B、C和D)同比例

10、混合于TM緩沖液，置于95℃水浴加熱2min，再置于冰浴降溫，即形成DNA四面體。利用瓊脂糖凝膠電泳法觀察DNA四面體的條帶位置，分析DNA四面體的構建情況。取不同摩爾比的DNA四面體和阿霉素混合，在黑色96孔板中靜置，待阿霉素充分嵌入DNA四面體后，即構建出載有阿霉素的DNA四面體。利用熒光光譜分析儀檢測阿霉素熒光光譜值的變化，分析DNA四面體的載藥情況;通過動態(tài)光散射儀表征其尺寸分布及Zeta電位;將載有阿霉素的DNA四面體與A54

11、9ADRr細胞共孵育48h，用MTS法檢測對腫瘤細胞的殺傷率，并測定其對A549ADRr細胞的殺傷作用是否優(yōu)于游離阿霉素。
　　結果：
　　(1)利用瓊脂糖凝膠電泳法觀察到DNA四面體的條帶位置高于其他兩組(A+B、A+B+C)。
　　(2)利用動態(tài)光散射儀測定了DNA四面體的粒徑和Zeta電位，結果顯示，平均粒徑在13.81nm左右，Zeta電位為-0.427mV。
　　(3)利用熒光光譜分析儀檢測阿霉素熒光光

12、譜值的變化，結果表明載藥四面體構建成功。
　　(4)MTS殺傷結果顯示，當阿霉素濃度≥15μmol/L時，載有阿霉素的DNA四面體在體外有助于逆轉A549 ADRr細胞對于阿霉素的耐藥性(p＜0.05)。
　　(5)DNA四面體自身對靶細胞無明顯殺傷作用。
　　結論：載有阿霉素的DNA四面體在體外有助于逆轉A549 ADRr細胞對于阿霉素的耐藥性。該結果提示，DNA四面體作為一種新型的納米載藥系統(tǒng)，在逆轉腫瘤耐藥性方面