干擾素-λ對乳腺癌、食管癌及惡性間皮瘤細(xì)胞系的抗增殖作用以及增強(qiáng)化療藥物療效的體外研究.pdf

1、目的:目前，在世界范圍內(nèi)癌癥總發(fā)病率呈逐漸上升趨勢，我國每年因癌癥去世的人數(shù)約150萬。傳統(tǒng)應(yīng)用手術(shù)、放療、化療等手段能夠達(dá)到一定的臨床治愈，但是仍存在一定的局限性。近年來，生物治療由于其治療的全身性、個(gè)體化等得到了臨床的認(rèn)可，生物治療包括:細(xì)胞因子治療、免疫活性細(xì)胞治療、誘導(dǎo)分化治療、基因治療等。目前，包括干擾素-α在內(nèi)的細(xì)胞因子治療腫瘤已經(jīng)應(yīng)用于臨床，并且取得了良好的療效。近幾年，人們發(fā)現(xiàn)了干擾素家族的新成員-干擾素λ，它的受體復(fù)合

2、體由特異性的IL-28Rα、IL-10Rβ鏈組成。干擾素λ與干擾素α具有相似的抗病毒、抗腫瘤細(xì)胞生長及免疫調(diào)節(jié)等作用，但與干擾素α相比，干擾素λ無明顯的骨髓抑制作用及毒副作用且其作用長效，目前干擾素λ在各項(xiàng)體外研究中初步顯示了抗腫瘤作用。本實(shí)驗(yàn)旨在通過檢測干擾素λ受體在乳腺癌細(xì)胞系，食管癌細(xì)胞系及惡性間皮瘤細(xì)胞系中表達(dá)，并確定其對于上述細(xì)胞系是否存在明顯的增殖抑制作用，進(jìn)而初步探索干擾素λ的抗癌機(jī)理及其聯(lián)合化療藥物時(shí)是否對腫瘤細(xì)胞系存在

3、協(xié)同抑制作用。此研究結(jié)果將為干擾素λ成為一種有效抗擊癌癥的新興生物治療手段提供理論依據(jù)。
　　 方法:首先采用PCR技術(shù)檢測乳腺癌231、453、MCF-7細(xì)胞，食管癌TE1、TE2、TE10、YES6、T.Tn細(xì)胞，惡性間皮瘤H2452、H2052、H226、211H、H28細(xì)胞，正常的食管上皮Het-1A細(xì)胞等14種細(xì)胞是否表達(dá)IFN-λ受體復(fù)合體;同時(shí)應(yīng)用MTT技術(shù)檢測經(jīng)IFN-λ處理后細(xì)胞的增殖情況;選取表達(dá)IFN-λ受

4、體且IFN-λ對細(xì)胞增殖有明顯抑制作用的細(xì)胞株，應(yīng)用MTT技術(shù)檢測IFN-λ聯(lián)合應(yīng)用化療藥物時(shí)，兩者是否存在協(xié)同作用;應(yīng)用westernblotting技術(shù)，檢測細(xì)胞系中caspase3、PARP、caspase8等，初步探索IFN-λ的抗腫瘤增殖機(jī)制。
　　 結(jié)果:
　　 1.乳腺癌、食管癌、正常的食管上皮細(xì)胞及惡性間皮瘤細(xì)胞中干擾素-λ受體復(fù)合體的表達(dá)情況
　　 乳腺癌細(xì)胞、食管癌細(xì)胞、正常的食管上皮細(xì)胞及惡

5、性間皮瘤細(xì)胞的RT-PCR產(chǎn)物在1％的瓊脂糖凝膠上電泳后，結(jié)果顯示:食管癌TE1、TE2、TE10、YES6、T.Tn細(xì)胞，正常的食管上皮Het-1A細(xì)胞、乳腺癌453細(xì)胞、惡性間皮瘤H2052細(xì)胞出現(xiàn)了與預(yù)期相符的片段，說明其表達(dá)IL-28Rα、IL-10Rβ基因，即表達(dá)IFN-λ受體復(fù)合體;而乳腺癌231、MCF-7細(xì)胞，惡性間皮瘤H2452、H226、211H、H28細(xì)胞未出現(xiàn)與預(yù)期相符的片段，說明其不表達(dá)IFN-λ受體復(fù)合體。提

6、示:IFN-λ受體復(fù)合體在不同細(xì)胞系中的表達(dá)具有特異性。
　　 2.IFN-λ對乳腺癌細(xì)胞、食管癌細(xì)胞、正常的食管上皮細(xì)胞及惡性間皮瘤細(xì)胞的增殖影響
　　 將以上14種細(xì)胞株分別分為5組進(jìn)行培養(yǎng)，分別是無處理組，IFN-λ（1ng/ml）處理組，IFN-λ（10ng/ml）處理組，IFN-λ(100ng/ml)處理組，IFN-λ(1000ng/ml)處理組。培養(yǎng)96h后應(yīng)用MTT法檢測細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示，不同濃度的干

7、擾素-λ對乳腺癌231、453、MCF-7細(xì)胞、惡性間皮瘤H2452、H2052、H226、211H、H28細(xì)胞、食管癌TE1、TE2、TE10、YES6細(xì)胞、正常的食管上皮Het-1A細(xì)胞不具有增殖抑制活性，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;不同濃度的干擾素-λ對食管癌T.Tn細(xì)胞具有明顯的增殖抑制活性，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;并且其增殖抑制活性在一定范圍內(nèi)隨著干擾素-λ濃度的升高而增強(qiáng)。提示:干

8、擾素-λ的抗腫瘤增殖活性在不同細(xì)胞中表現(xiàn)不同。
　　 3.IFN-λ與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)對細(xì)胞增殖的影響
　　 選取IFN-λ受體陽性且IFN-λ對其增殖抑制作用明顯的食管癌T.Tn細(xì)胞株
　　 3.1.以無處理組的細(xì)胞增殖活性為100％，單純應(yīng)用IFN-λ（10ng/ml）組細(xì)胞增殖活性為93％，單純應(yīng)用5-FU(10uM)組細(xì)胞增殖活性為63.5％，同時(shí)應(yīng)用IFN-λ(10ng/ml)和化療藥物5-FU(10

9、uM)組細(xì)胞增殖活性為35.8％;經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 3.2.以無處理組的細(xì)胞增殖活性為100％，單純應(yīng)用IFN-λ（10ng/ml）組的細(xì)胞增殖活性為96.3％，單純應(yīng)用CDDP(10uM)組的細(xì)胞增殖活性為66.2％，同時(shí)應(yīng)用IFN-λ（10ng/ml）和CDDP(10uM)組的細(xì)胞增殖活性為45.5％;經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 提示:IF

10、N-λ可明顯增強(qiáng)化療藥物5-FU或CDDP對細(xì)胞的增殖抑制活性，兩者同時(shí)應(yīng)用時(shí)可產(chǎn)生協(xié)同作用。
　　 4.IFN-λ誘導(dǎo)食管癌T.Tn細(xì)胞凋亡酶的檢測
　　 4.1.IFN-λ可誘導(dǎo)剪切形式的caspase3蛋白增加
　　 正常細(xì)胞內(nèi)，caspase3蛋白以非活性狀態(tài)存在，啟動(dòng)激活時(shí)可將部分肽鏈進(jìn)行剪切，轉(zhuǎn)變成剪切形式的具有激酶活性的caspase3蛋白，它是細(xì)胞凋亡程序的重要啟動(dòng)者和執(zhí)行者。Western蛋白印

11、跡結(jié)果顯示:IFN-λ可顯著上調(diào)食管癌T.Tn細(xì)胞中剪切形式的caspase3蛋白表達(dá)。提示:IFN-λ通過激活caspase3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　 4.2.IFN-λ可誘導(dǎo)剪切形式的PARP蛋白增加
　　 PARP(polyADP-ribosepolymerase)是細(xì)胞凋亡核心成員胱天蛋白酶(caspase)的切割底物。Western蛋白印跡結(jié)果顯示:IFN-λ可顯著上調(diào)食管癌T.Tn細(xì)胞中剪切形式的PARP蛋白表達(dá)

12、。提示:IFN-λ通過激活PARP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　 4.3.IFN-λ可誘導(dǎo)活化形式的caspase8蛋白增加
　　 在正常細(xì)胞內(nèi)caspase8通常以酶原的形式存在，在細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中被激活。Western蛋白印跡結(jié)果顯示:IFN-λ可顯著上調(diào)食管癌T.Tn細(xì)胞中剪切形式的caspase8蛋白表達(dá)。提示:IFN-λ通過激活caspase8誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)論:
　　 1.IFN-λ受體