乳腺髓樣癌Bcap-37細(xì)胞系腫瘤干細(xì)胞的分選鑒定及槐耳清膏對(duì)乳腺癌干細(xì)胞作用的初步研究.pdf

1、乳腺癌是我國(guó)女性發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤,其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。髓樣癌是乳腺癌中的一種特殊組織學(xué)類(lèi)型,其獨(dú)特的病理特征和較好的預(yù)后之間仍有許多不明之處,需要更進(jìn)一步的研究。腫瘤的治療一直是困擾臨床的難點(diǎn),因此,篩選抗腫瘤的藥物成為研究熱點(diǎn)。
　　腫瘤干細(xì)胞(cancerstemcells,CSCs)是一群具有較強(qiáng)自我更新能力、能夠多向分化的細(xì)胞,且與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)相關(guān)。研究表明利用標(biāo)記物能夠分選出某種腫瘤中的CSCs

2、。乳腺髓樣癌的干細(xì)胞標(biāo)記物尚無(wú)報(bào)道,因此,尋找和鑒定分選乳腺髓樣癌干細(xì)胞的腫瘤標(biāo)記物,是進(jìn)一步研究乳腺髓樣癌生物學(xué)特性等的基礎(chǔ)。近年來(lái)還研究發(fā)現(xiàn):腫瘤的復(fù)發(fā)與腫瘤干細(xì)胞具有明顯相關(guān),因此,尋找能夠殺傷CSCs的藥物對(duì)臨床治療顯得尤為重要。
　　針對(duì)上述問(wèn)題,本研究以乳腺髓樣癌細(xì)胞系Bcap37為細(xì)胞模型,PROCR(endothelialproteinCreceptor)和ESA(epithelialspecificantigen

3、)為分選標(biāo)記物,檢測(cè)Bcap37細(xì)胞中PROCR+/ESA+細(xì)胞比例,并通過(guò)NON/SCID小鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn);克隆形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)以及干性相關(guān)基因檢測(cè)等體外實(shí)驗(yàn),以證明PROCR+/ESA+分選的細(xì)胞是否具有干細(xì)胞特征。為了驗(yàn)證槐耳清膏是否對(duì)干細(xì)胞具有抑制作用,將槐耳清膏分別加入到PROCR+/ESA+的細(xì)胞中,并觀察給藥前后細(xì)胞克隆形成能力的變化;同時(shí),為進(jìn)一步驗(yàn)證槐耳清膏是否對(duì)腫瘤干細(xì)胞有殺傷或者抑制作用,本研究選用了乳腺癌另

4、一細(xì)胞模型--SUM159細(xì)胞系進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證,通過(guò)槐耳清膏給藥前后對(duì)乳腺癌SUM159細(xì)胞成球能力、克隆形成能力的影響,并且運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)給藥前后,SUM159中ALDH1hing比例的變化。初步研究槐耳清膏是否對(duì)乳腺癌干細(xì)胞(breastcancerstemcells,BCSCs)具有能殺傷或者抑制效果,為臨床治療提供新的線(xiàn)索。
　　研究方法和主要結(jié)果：
　　1.乳腺髓樣癌Bcap-37細(xì)胞系腫瘤干細(xì)胞的分選鑒定<

5、br>　　方法:以CD24/CD44、PROCR/ESA為分選標(biāo)記物,運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)分選乳腺髓樣癌Bacp-37細(xì)胞,通過(guò)體外克隆形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)、干性相關(guān)基因檢測(cè)等實(shí)驗(yàn),體內(nèi)NOD/SCID動(dòng)物成瘤模型來(lái)證明:CD24/CD44不是該細(xì)胞系最好的干細(xì)胞標(biāo)記物,而以PROCR+/ESA+分選的細(xì)胞具有干細(xì)胞特征。
　　結(jié)果：
　　1.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Bcap37細(xì)胞系中,CD44+/CD24-/low的比例為52.7％,

6、PROCR+/ESA+的比例為3.2%;克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:CD44+/CD24-/low分選細(xì)胞克隆形成的數(shù)目和NonCD44+/CD24-/low分選的細(xì)胞克隆形成數(shù)目無(wú)差異(P>0.05);PROCR+/ESA+細(xì)胞克隆形成的數(shù)目大于PROCR-/ESA-細(xì)胞(P<0.05),提示PROCR+/ESA+細(xì)胞具有較強(qiáng)的克隆形成能力。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)表明:PROCR+/ESA+的細(xì)胞能夠在48小時(shí)以?xún)?nèi)從G1期進(jìn)入G2和S期,而PROCR

7、-/ESA-的細(xì)胞幾乎不進(jìn)入分裂周期;干性相關(guān)基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)表明:PROCR+/ESA+的細(xì)胞高表達(dá)NANOG、OCT4和BMI1(P<0.05);NOD/SCID動(dòng)物成瘤模型實(shí)驗(yàn)表明:PROCR+/ESA+的細(xì)胞在成瘤的數(shù)目、成瘤的體積均要大于PROCR-/ESA-細(xì)胞(P<0.05)。
　　2.槐耳清膏對(duì)乳腺癌干細(xì)胞作用的初步研究
　　方法:觀察槐耳清膏給藥前后對(duì)PROCR+/ESA+的Bcap-37細(xì)胞克隆形成的影響;應(yīng)

8、用CCK-8法檢測(cè)槐耳清膏對(duì)SUM-159細(xì)胞的IC50值,并觀察給藥前后SUM-159細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、對(duì)克隆形成能力和成球能力的影響,以及用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)給藥前后SUM-159細(xì)胞的ALDH1high細(xì)胞比例變化。
　　結(jié)果:槐耳清膏能抑制PROCR+/ESA+的Bcap-37細(xì)胞的克隆形成(P<0.05);CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示:槐耳清膏對(duì)Sum-159細(xì)胞系的IC50值約為10mg/mL。以濃度為0mg/mL、1mg/mL、

9、10mg/mL的槐耳清膏作用于Sum-159細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)隨著濃度的增加,克隆形成的菌落數(shù)目逐漸減少(p<0.05)。成球數(shù)目和大小也逐漸降低(p<0.05)。以10mg/mL的濃度作用該細(xì)胞后,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ALDH1比例發(fā)現(xiàn),ALDH1high細(xì)胞的比例由給藥前的2.8%降到1.5%,而以1μg/mL濃度的紫杉醇作用該細(xì)胞后,ALDH1high細(xì)胞的比例由給藥前的2.8%升到9.1%。
　　結(jié)論：
　　1、FCM分選乳腺髓

10、樣癌細(xì)胞系Bcap37中PROCR+/ESA+亞群細(xì)胞具有較強(qiáng)的成瘤能力和多向分化能力,具有CSCs的特性。PROCR+/ESA+可作為乳腺髓樣癌細(xì)胞系Bcap-37的CSCs細(xì)胞亞群分選標(biāo)記物。
　　2、槐耳清膏對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系Bcap37細(xì)胞的克隆形成、Sum159細(xì)胞的克隆形成和成球能力具有明顯的抑制作用。同時(shí)能夠降低Sum-159細(xì)胞中ALDH1high細(xì)胞的比例,提示槐耳清膏可能對(duì)乳腺癌Sum-159細(xì)胞中的干細(xì)胞具有一