TRMU-Knockdown小鼠胰島β細胞系的構(gòu)建及對其功能影響的研究.pdf

1、目的：
　　本研究實驗擬構(gòu)建針對小鼠TRMU基因mRNA的特異性RNAi慢病毒表達載體，在小鼠胰腺β細胞(Min6細胞)中，從轉(zhuǎn)錄水平上抑制TRMU基因的表達，干擾tRNA的修飾，觀察β細胞的功能變化來建立一種研究線粒體糖尿病發(fā)病機制的細胞模型。本研究有兩個主要目標：(1)建立線粒體功能障礙的β細胞系，可用于線粒體糖尿病發(fā)病分子機制的研究工作；(2)闡明線粒體功能障礙影響β細胞功能的部分機制。
　　方法：
　　1、構(gòu)建

2、TRMU-RNAi慢病毒表達載體本實驗選擇小鼠TRMU基因作RNA干擾的靶基因，先設(shè)計合成針對TRMU基因mRNA不同位點的shRNA序列，再克隆到線性化的pLVX-shRNA2-GFP慢病毒載體上，分別構(gòu)建出不同靶點的RNAi慢病毒表達載體。
　　2、包裝生產(chǎn)TRMU-RNAi慢病毒將構(gòu)建并測序鑒定好的RNAi慢病毒載體質(zhì)粒與慢病毒包裝系統(tǒng)(Lenti-X TMHTX Packaging System)中的輔助質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)染慢病

3、毒包裝細胞，即293T細胞。在293T細胞中包裝出具有活性的慢病毒顆粒，濃縮病毒液，用逐孔稀釋法進行病毒滴度的測定。
　　3、TRMU-RNAi慢病毒對小鼠胰島β細胞(Min6)功能的影響用包裝好的RNAi慢病毒感染Min6細胞，觀察細胞出現(xiàn)的形態(tài)學變化；實時定量PCR(Real time PCR，RT-PCR)法檢測干擾慢病毒對細胞內(nèi)TRMU基因轉(zhuǎn)錄水平的抑制效應(yīng)，以及干擾tRNA的修飾對tRNA穩(wěn)定性的影響；激光共聚焦技術(shù)對轉(zhuǎn)

4、染和未轉(zhuǎn)染的細胞進行Ca++濃度的檢測；對其胰島素分泌進行檢測與分析。同時，設(shè)置陰性對照病毒感染組和未感染病毒的正常細胞組做對照。
　　結(jié)果：
　　1、構(gòu)建TRMU-RNAi慢病毒表達載體本實驗成功構(gòu)建了針對TRMU基因mRNA不同位點的RNAi慢病毒表達載體質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定和測序鑒定干擾片斷的堿基序列以及插入的位點完全正確。
　　2、包裝生產(chǎn)TRMU-RNAi慢病毒將重組慢病毒載體質(zhì)粒與輔助包裝載體質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)染2

5、93T細胞，包裝并擴增慢病毒，獲得了高滴度慢病毒上清液。
　　3、TRMU-RNAi慢病毒對小鼠胰島β細胞(Min6)功能的影響通過RT-PCR檢測RNAi慢病毒感染Min6細胞后，可以高效抑制TRMU基因的表達，并影響了tRNA的穩(wěn)定性。激光共聚焦技術(shù)對轉(zhuǎn)染細胞進行Ca++濃度的檢測，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)Ca++濃度降低。最后，通過胰島素釋放實驗證明了RNAi慢病毒感染Min6細胞后，胰島素分泌水平明顯受到了抑制。
　　結(jié)論：