精原干細(xì)胞移植治療因大劑量化療所致不育的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，青春期前腫瘤患者的臨床治愈率顯著增加，生存率顯著提高，但他們中許多要長期面對(duì)因接受大劑量化療所引起的不育問題，目前醫(yī)學(xué)對(duì)這類醫(yī)源性不育尚沒有治療的方法。精原干細(xì)胞具有永生化和多能化潛能，是精子形成的前體細(xì)胞，在睪丸微環(huán)境中具有增殖和分化的能力。精原干細(xì)胞移植為男性不育癥的治療開啟了一扇新的大門。本實(shí)驗(yàn)中我們探討精原干細(xì)胞的表面標(biāo)志物及其分離純化方法，觀測(cè)精原干細(xì)胞移植后的體內(nèi)遷移、增殖和分化過程，及其分化形成成熟精子

2、的能力，為大劑量化療所致不育的患者通過精原干細(xì)胞移植的方法來治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一部分 睪丸組織中精原干細(xì)胞的免疫化學(xué)研究 目的 探討精原干細(xì)胞的表面標(biāo)志物。 方法 對(duì)10日齡SD大鼠睪丸組織切片進(jìn)行HE染色。采用免疫組織化學(xué)和免疫電鏡的方法，觀察ct6-Integrin與c-kit在10日齡大鼠睪丸組織中的表達(dá)與分布情況。 結(jié)果：睪丸組織中所有精原細(xì)胞特異性表達(dá)a6-Integ

3、rin，這其中包括未分化型與分化型精原細(xì)胞。c-kit表達(dá)于分化型精原細(xì)胞中。a6-Integrin與c-kit可作為特定時(shí)期精原細(xì)胞的表面標(biāo)志，用于精原細(xì)胞的鑒定。精原干細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)有a6-Integrin或c-kit陽性表達(dá)，ct6-Integrin與c-kit可作為精原干細(xì)胞增殖與分化階段的表面標(biāo)志。 第二部分 精原干細(xì)胞的分離純化及其鑒定 目的 探討精原干細(xì)胞的分離純化方法及純化后的細(xì)胞特性。

4、 方法 應(yīng)用復(fù)合酶消化法制備10日齡SD大鼠的睪丸單細(xì)胞懸液，采用差速貼壁結(jié)合非連續(xù)性Percoll密度梯度離心的方法純化精原細(xì)胞。分別以c-kit和a6-Integrin作為細(xì)胞標(biāo)記，觀察睪丸組織中的精原細(xì)胞與純化后細(xì)胞的免疫化學(xué)特征。通過流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)純化后細(xì)胞表達(dá)c-kit和tx6-Integrin的陽性率。 結(jié)論 采用復(fù)合酶消化、差速貼壁結(jié)合非連續(xù)性Percoll密度梯度離心的方法純化精原細(xì)胞，

5、能獲得純度和活性較高的精原細(xì)胞，并能使精原干細(xì)胞相對(duì)富集。 第三部分精原干細(xì)胞移植后的體內(nèi)遷移、增殖和分化研究 目的 觀測(cè)精原干細(xì)胞移植后的體內(nèi)遷移、增殖和分化過程，為因化療所致不育的患者探索一種新的治療方法。 方法 以出生后6～10d的雄性Cs7BL／6小鼠為供體，通過復(fù)合酶消化、差速貼壁結(jié)合非連續(xù)性Percoll密度梯度離心的方法獲得待移植細(xì)胞懸液，并用PKH26-GL對(duì)待移植細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記

6、。以與供體同系生的C57BL／6雄性小鼠為受體，在出生后6周予腹腔注射白消安溶液，白消安的劑量為40mg／Kg，可破壞內(nèi)源性精原細(xì)胞，給藥后4～6周采用曲細(xì)精管微注射的方法移植細(xì)胞。對(duì)移植后受體睪丸組織細(xì)胞進(jìn)行熒光追蹤分析，觀察所移植的細(xì)胞體內(nèi)遷移過程。以未接受化療和細(xì)胞移植的正常同系生小鼠作為平行陽性對(duì)照組(1組)，以單側(cè)睪丸曲細(xì)精管微注射移植細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組(3組)，以對(duì)側(cè)睪丸曲細(xì)精管微注射移植細(xì)胞介質(zhì)作為平行陰性對(duì)照組(2組)。在3

7、組接受移植后一月、二月、三月分別取各組睪丸組織，進(jìn)行HE染色，并采用WesternBlot和RFO—PCR的方法分析各組睪丸組織表達(dá)a6-Integrin、c-kit、SCF蛋白和mRNA的差異，觀測(cè)精原干細(xì)胞移植后的體內(nèi)增殖和分化過程。 結(jié)論 精原干細(xì)胞移植后，首先從曲細(xì)精管管腔向曲細(xì)精管基底膜遷移；在移植后一月已全部遷移至曲細(xì)精管基底膜上，并開始在同系受體睪丸內(nèi)增殖和分化；在移植后三月可分化形成精子細(xì)胞。白消安對(duì)曲細(xì)

8、精管內(nèi)的精原細(xì)胞毒性明顯，對(duì)受體Sertoli細(xì)胞也有毒性作用，但較精原細(xì)胞對(duì)化療藥物的毒性反應(yīng)輕，且能隨著化療后時(shí)間的延長有所恢復(fù)。在大劑量化療后，生精上皮內(nèi)仍存在一定數(shù)量的Sertoli細(xì)胞，這種精子發(fā)生的微環(huán)境并沒有破壞，外源性精原干細(xì)胞移植后，能在受體Sertoli細(xì)胞所提供的微環(huán)境中增殖和分化。外源性精原干細(xì)胞移植后，在同系受體生精上皮內(nèi)具有克隆增殖和分化的能力。這為大劑量化療所致不育的患者，通過精原干細(xì)胞移植的方法來治療提供

9、了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第四部分 精原干細(xì)胞移植后的生精功能研究 目的 觀測(cè)精原干細(xì)胞移植后的生精功能，并觀測(cè)冷凍保存對(duì)精原干細(xì)胞移植后增殖分化的影響，為實(shí)際應(yīng)用精原干細(xì)胞移植技術(shù)奠定理論基礎(chǔ)。 方法 分別以出生后lOd的雄性SD大鼠和出生后6～10d的雄性C57BL／6小鼠為供體，通過復(fù)合酶消化、差速貼壁結(jié)合非連續(xù)性Percoll密度梯度離心的方法獲得待移植細(xì)胞懸液，分別在冷凍保存前后用流式細(xì)胞儀

10、檢測(cè)細(xì)胞活性率。以雄性BALB~裸小鼠為受體，在出生后6周予腹腔內(nèi)注射白消安溶液，給藥后4～6周采用曲細(xì)精管微注射的方法移植細(xì)胞。整個(gè)移植實(shí)驗(yàn)過程分三階段進(jìn)行。第一階段，將未冷凍保存過的C57BL／6小鼠精原干細(xì)胞移植到BALB／c裸小鼠睪丸內(nèi)(設(shè)為未冷凍保存組)，分時(shí)間段用SEM觀察生精過程，分析受體睪丸內(nèi)ct6-Integrin蛋白表達(dá)情況以及移植后三月進(jìn)行IVF實(shí)驗(yàn)。第二階段，將SD大鼠精原干細(xì)胞移植到BALB／c裸小鼠睪丸內(nèi)，移

11、植后三月用SEM觀察精子形態(tài)。第三階段，將冷凍保存過的C57BL／6小鼠精原干細(xì)胞移植到BALB／c裸小鼠睪丸內(nèi)(設(shè)為冷凍保存組)，分時(shí)間段分析受體睪丸內(nèi)a6-Integrin蛋白表達(dá)情況并與未冷凍保存組進(jìn)行比較。 結(jié)論 精原干細(xì)胞移植后能在受體生精上皮中克隆增殖，并能分化形成成熟的精子。采用常規(guī)方式冷凍保存的精原干細(xì)胞，移植后不影響其克隆增殖和分化形成精子的能力，這對(duì)臨床應(yīng)用精原干細(xì)胞移植技術(shù)具有重要的實(shí)用意義。在全身