10-HDA生物合成相關(guān)酶基因在畢赤酵母中的表達.pdf

1、10-羥基-2-癸烯酸（10-hydroxy-2-decenoic acid，10-HDA）是一種不飽和中鏈脂肪酸，是蜂王漿的主要活性成分，目前自然界中主要在蜂王漿中發(fā)現(xiàn)，因此又稱王漿酸。10-HDA不僅是蜂王漿的主要質(zhì)量指標(biāo)，而且研究表明10-HDA具有抗菌、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤等多種重要的生理功能，因此，10-HDA具有重要的醫(yī)藥和保健價值，應(yīng)用前景廣泛。對10-HDA的生物合成途徑的探索對于了解其生物合成的本質(zhì)和對其實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)有著

2、重要的意義。
　　本研究通過克隆10-HDA生物合成相關(guān)基因蜜蜂電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白β基因和3-酮脂酰輔酶A硫解酶基因，構(gòu)建真核表達載體，整合到畢赤酵母基因組進行表達，為進一步探索10-HDA生物合成途徑奠定基礎(chǔ)。硫酯酶在生物體內(nèi)能催化水解脂酰?；d體蛋白和飽和脂肪脂酰鏈，對中鏈脂肪酸(Medium chain fatty acids，MCFAs)的積累起著關(guān)鍵作用。我們通過克隆擬南芥ACP硫酯酶基因，構(gòu)建真核表達載體，分析外源基因的

3、插入對畢赤酵母代謝產(chǎn)脂肪酸的影響，探索構(gòu)建微生物工程菌代謝產(chǎn)10-HDA的可行性。以擬南芥cDNA為模板，PCR擴增得到其脂酰-ACP硫酯酶基因AtFatA，經(jīng)EcoRⅠ/XbaⅠ雙酶切后連接至同樣雙酶切的質(zhì)粒中，獲得重組質(zhì)粒pPICZαA-AtFatA。將重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中，通過Zeocin抗性篩選，挑選出陽性克隆子并搖瓶發(fā)酵誘導(dǎo)，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析獲得明顯目的蛋白條帶，成功構(gòu)建AtFatA的真核表達系統(tǒng)