大麻素受體CB2抑制劑AM630對(duì)鈦顆粒誘導(dǎo)下巨噬細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[目的]研究大麻素受體CB2抑制劑AM630對(duì)鈦顆粒誘導(dǎo)下巨噬細(xì)胞的影響，為臨床治療人工關(guān)節(jié)假體無菌性松動(dòng)提供新的作用靶點(diǎn)。
　　 [方法]采用小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞，用四甲基偶氮噻唑藍(lán)（MTT）比色還原法觀察AM630對(duì)RAW264.7細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測(cè)AM630作用于不同濃度的鈦顆粒誘導(dǎo)下RAW264.7細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）細(xì)胞因子的量的變化

2、。光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，caspase-3免疫組化法、流式細(xì)胞儀（FCM）分析誘導(dǎo)下RAW264.7細(xì)胞的凋亡等作用。TRAP染色觀察AM630對(duì)RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力的影響，免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)ERK蛋白水平變化。
　　 [結(jié)果]大麻素受體CB2選擇性抑制劑 AM630在O-200nM濃度范圍內(nèi)不影響RAW264.7細(xì)胞增殖。小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞易貼壁，增殖速度快。加入鈦

3、顆粒后，光鏡下可見RAW264.7細(xì)胞吞噬鈦顆粒現(xiàn)象，并隨著鈦顆粒濃度增高，細(xì)胞增殖生長(zhǎng)能力下降。培養(yǎng)上清液中 TNF-α細(xì)胞因子含量隨鈦顆粒濃度（0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml）增加而增加，與對(duì)照空白組相比p<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而IL-1β細(xì)胞因子含量在鈦顆粒濃度為0.5mg/ml、1mg/ml時(shí)與對(duì)照空白組有差別。加入AM630（100nM）后，細(xì)胞因子含量明顯下降。caspase-3免疫組化染色后鏡下可見

4、鈦顆粒組及AM630組均出現(xiàn)細(xì)胞胞漿呈黃色的caspase-3陽性細(xì)胞；并可見一些細(xì)胞皺縮，核邊緣化、固縮或碎裂，甚至無核的胞漿深染的凋亡小體。在流式細(xì)胞DNA直方圖上，鈦顆粒組（0.1mg/ml）出現(xiàn)明顯高聳的亞二倍體“凋亡峰”，細(xì)胞周期被阻滯在“S”期，其“S”期的比率為0.579±0.0105，明顯高于對(duì)照組細(xì)胞的0.423±0.0079（t=23.74，p<0.01），而其G2/M期細(xì)胞明顯減少。單純AM630組亦出現(xiàn)細(xì)胞凋亡亞

5、峰，其“S”期的比率為0.436±0.0116，和對(duì)照組細(xì)胞相似（t=1.88，p=0.1086>0.05）。在RANKL作用下RAW264.7細(xì)胞可向破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，可見許多細(xì)胞胞漿呈紅色的TRAP染色陽性細(xì)胞，Western blot法檢測(cè)ERK磷酸化水平顯著增高；而加入AM630組TRAP染色陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，ERK磷酸化水平降低。
　　 [結(jié)論]（1）鈦顆粒能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞（RAW264.7細(xì)胞）分泌 TNF-α、IL-1